产丁醇大肠杆菌工程菌的构建

【目的】为了在大肠杆菌(Escherichia coli)中导入改良的丁醇合成途径,使非生产菌株大肠杆菌具备产丁醇的能力。【方法】克隆大肠杆菌乙酰转移酶基因atoB和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)丁醇合成途径关键酶基因(crt、hbd、adhE),构建多顺反子表达质粒pSE380-atoB-adhE-crt-hbd;克隆齿垢密螺旋体(Treponema denticola)反式烯酰辅酶A还原酶基因ter,构建表达质粒pSTV29-ter,并将双质粒导入到大肠杆菌。【结果】构建的工程菌能半厌氧发酵产微量丁醇,产量为0.08g/L。【结论】大肠杆菌中的丁醇合成途径导入成功,构建了产丁醇的大肠杆菌工程菌。     

丙酮丁醇酸菌固定化技术用于丙酮丁醇发酵的研究

以聚乙烯醇（PVA0为基体的载体埋内酮丁醇梭菌（Clostridium-acetobutylicum）制备固定化细胞,同时用玉米芯为载体吸附丙酮丁醇梭菌制备固定化细胞,并分别进行了静止分批、循环换玉米培养基发酵生产丙酮丁醇的试验。     

以甘薯为原料发酵生产丙酮-丁醇-乙醇的研究

【目的】研究以甘薯为原料发酵生产丙酮-丁醇-乙醇(ABE)的可行性。【方法】以本研究分离鉴定的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)J-3-3为生产菌株,通过发酵培养基和发酵条件的优化,确定最佳的发酵工艺条件。发酵产物采用气相色谱的内标法测定。【结果】最佳发酵培养基组成:甘薯液化液初糖浓度为100g/L,豆粕8g/L,KH_2PO_4 0.8g/L,FeSO_4·7H_2O 0.06g/L。最佳发酵条件:温度37℃,初始pH自然(pH值为5.8),种龄22h,接种量10%。在此发酵工艺条件下发酵60h,溶剂产量达到最大,丙酮、乙醇和丁醇的产量分别为6.98g/L、1.16g/L和15.34g/L,总溶剂23.48g/L。【结论】研究结果表明,以甘薯为原料发酵生产丙酮-丁醇-乙醇是可行的,这为拓宽发酵法生产丙酮-丁醇-乙醇的原料来源以及甘薯的深加工提供了新的思路。     

不同C源对丙酮丁醇梭菌产丁醇的影响

对丙酮丁醇梭菌在以葡萄糖、木糖、蔗糖、混合糖、玉米芯酸解糖液分别作C源的P2培养基中的产丁醇状况进行研究.结果表明:不同C源对丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇有显著的影响;葡萄糖为底物时,丁醇产量最高达到13.50g/L,总溶剂为19.66 g/L;蔗糖为底物时,丁醇所占比例都在70%以上,丁醇产量可达12 g/L;木糖、混合糖为底物时,丁醇产量在10 g/L左右;只有丙酮丁醇梭菌14-28能利用玉米芯酸解糖液发酵产丁醇,丁醇产量为7 g/L.     

丙酮丁醇梭菌发酵玉米秸秆生产丁醇

以丙酮丁醇梭菌为发酵用菌株发酵水蒸气爆破玉米秸秆酶解上清液生产丁醇,研究了酶解上清液浓度、初始pH值以及菌液接种量对丁醇产量的影响,并通过正交试验来确定营养元素的最佳添加量.结果表明:在丙酮丁醇梭菌发酵水蒸气爆破玉米秸秆酶解上清液生产丁醇的最佳条件下(上清液糖浓度57.5g/L、初始pH值6.3,菌液接种量6%,发酵温度37℃,营养元素酵母膏、乙酸铵、磷酸二氢钾、烟酰胺添加量分别为0.8、6.0、0.5、0.25 g/L),丁醇产量达9.726 g/L;水蒸气爆破玉米秸秆酶解液中有抑制产生溶剂的物质,少量烟酰胺能有效促进丁醇生产.     

丙酮丁醇梭菌发酵糖蜜生产丁醇的发酵条件优化

运用单因素试验结合正交设计法优化丙酮丁醇梭菌发酵甘蔗糖蜜生产丁醇的发酵条件,并进行验证试验.得到发酵条件的最优组合为(NH4)2HPO4的添加量为0.3％,H2NCONH2的添加量为0.1％、Na2 HPO4的添加量为0.5％,KH2 PO4的添加量为0.5％,L-半胱氨酸盐酸盐-水物的添加量为0.025％,蛋白胨的添...     

大肠杆菌丁醇生产菌的构建及检测

用合成生物学和代谢工程技术,筛选并克隆丁醇合成途径中酶活性较高的atoB,hbd,crt,ter,adhE2等5个关键酶基因,先通过重组PCR构建pUC18-ato B-hbd-crt-ter质粒,再将串联基因atoB-hbd-crt-ter和基因adhE2克隆至质粒pET-21b中,构建含丁醇合成途径的表达载体p ET-21b-ato B-hbd-crt-ter-adh E2,将其转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中制备工程菌株.对样品进行IPTG诱导表达检测与色谱分析的结果表明,已合成出关键酶蛋白并产生一定量的丁醇.     

基于双向电泳技术的丙酮丁醇梭菌ATCC824不同产物阶段膜蛋白质组比较

建立丙酮丁醇梭菌在产酸阶段和产有机溶剂阶段的膜蛋白质组;并进行比较分析。研究采用差速离心法提取了该菌在产酸阶段和产有机溶剂阶段的膜蛋白,进行双向电泳分离后,对差异蛋白进行质谱分析。不同生长阶段膜蛋白质组存在明显差异,经质谱鉴定发现9个差异蛋白质,其中3个在产酸阶段高表达,6个在产有机溶剂阶段高表达。生物信息学分析表明,大部分蛋白含有明确的膜定位信息。产酸阶段高表达蛋白多与细胞信号转导有关,而产有机溶剂阶段高表达蛋白功能分布相对复杂。丙酮丁醇梭菌在不同产物阶段的差异膜蛋白被成功鉴定,它们可能在不同产物阶段的转换和细胞信号转导等过程中起到重要调控作用。     

大肠杆菌生产重组人bFGF的发酵条件

对含有具有氨苄抗性、Ｌａｃ启动子和编码人碱性成纤维细胞生长因子（ｈ－ｂＦＧＦ）基因质粒的大肠杆菌的发酵条件进行了研究。为了获得ｈ－ｂＦＧＦ高效表达的最佳条件，进行了摇瓶试验。在ＩＰＴＧ诱导作用下，ｈ－ｂＦＧＦ可以分泌到胞浆中，采用连续流加葡萄糖的高密度分批发酵工艺，经１１ｈ发酵可以获得菌体光密度值（ＯＤ值）达３８，产量达２００ｍｇ／Ｌ和ｈ－ｂＦＧＦ。经纯化后得到的高纯度ｈ－ｂＦＧＦ其理化及生物学特     

生物丁醇研究现状及进展

生物丁醇是具有特有优势的新生代生物能源,有着巨大的发展潜力。论述了生物丁醇在国内外的研究进展,介绍了丁醇作为新型生物燃料的优势,并对生物丁醇的发展前景进行了展望。     

Expression of self-incompatibility ribonucleases of Antirrhinum in Escherichia coli

Self-incompatibility is an intraspecific reproductive barrier to prevent self-fertilization in the flowering plants.In many species,self-incompatibility is controlled by a single S locus with multiple alleles.So far,the only gene known in the S locus of the Solanaceae,Scrophulariaceae and Rosaceae encodes a class of ribonucleases,called self-incompatibility ribonucleases (S RNases),which have been shown to mediate stylar expression of self-incompatible reaction.As the first step to investigate their three-dimensional structure,we successfully expressed three biologically active S RNases of Antirrihnum (S2,S4 and S5) in Escherichia coli (E.coli).Their functional expressions caused no detrimental effect on host bacteria growth and provided a basis for a large scale preparation of S RNase proteins.Possible reasons for non-lethality of S RNases on E.coli are discussed.     

透明颤菌血红蛋白基因在产TRAIL蛋白大肠杆菌中的克隆表达

为解决大肠杆菌高密度发酵生产TRA IL过程中的供氧矛盾,提高菌体的发酵密度,在大肠杆菌中引入透明颤菌血红蛋白基因(vgb)。聚合酶链反应(PCR)检验和CO差光谱法检验表明:vgb基因能够在C 600(pBV 220-TRA IL)中表达并受溶氧调控,重组菌CTV具有良好的遗传稳定性。3.7 L发酵罐实验表明:在同样的发酵条件下,含vgb基因的重组菌CTV的最高菌体密度为对照菌的1.64倍,达到50.6 g/L,乙酸积累为对照菌的55.6%,TRA IL蛋白产量提高了70%,达到2.8 g/L。     

抗CEACAM5纳米抗体在大肠杆菌中的高效周质表达

纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性高、特异性强以及能够穿过血脑屏障等众多优势,而且其能够通过大肠杆菌、酵母等简单微生物大量表达。大肠杆菌周质表达纳米抗体是目前纳米抗体制备主要的方法之一,但是纳米抗体的表达水平还相对较低。以pET22b和pMES4为载体构建了两种重组表达质粒,并且比较了他们在不同宿主菌中表达纳米抗体的情况。结果表明,以pMES4为载体的大肠杆菌能够在周质中可溶性表达纳米抗体,而以pET22b为载体的大肠杆菌表达的纳米抗体无法分泌到周质空间中。随后,通过IPTG浓度优化及5 L发酵罐过程,控制实现了纳米抗体在大肠杆菌周质中的表达量达到308. 32 mg/L。研究提供了一种高效表达纳米抗体的方法,为纳米抗体的规模化制备奠定了技术基础。     

白喉毒素突变体CRM197原核表达载体构建及其蛋白表达

将合成的CRM197基因片段克隆到表达载体pBAD-DEST49中,转化到大肠杆菌菌株（ATCCMC1061）．经阿拉伯糖诱导,CRM197获得高效表达．目的蛋白主要以包涵体形式存在,变性、复性后经DEAE阴离子交换后获得高于95％纯度的CRM197样品．用该样品做Westernblotting鉴定后,能得到单一的特异性条带．本实验的表达策略,为CRM197进一步生产及应用奠定基础．     

利用tyrB与aspA基因在大肠杆菌中的偶联表达制备L-苯丙氨酸

报道了利用tyrB与aspA串联表达来合成苯丙氨酸．首先将抄当与aspA串联在质粒pBV221上,构成串联表达质粒pBV-tyrB-aspA;然后将该重组质粒转化到E．coli K36菌株中表达．对基因编码的相关酶活性以及工程菌利用FA和PPA生成Phe进行研究,结果表明：利用AspA和TyrB的偶联反应可以有效的提高E．coli K36合成L-苯丙氨酸的能力．     

大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin基因的克隆及表达

以大肠杆菌XL1blue为模板，通过PCR技术扩增大肠杆菌硫氧还蛋白基因，并将目的基因分别连接到克隆载体pUC18和表达载体pTrcHisC上，构建重组质粒．重组质粒pTrcHisC-TRX在大肠杆菌中高效表达，最后利用固定化金属螫合亲和层析技术(IMAC)获得较纯的目的蛋白，为进一步研究硫氧还蛋白的功能及其应用提供了条件．     

Optimization of butanol production from corn straw hydrolysate by <Emphasis Type="Italic">Clostridium acetobutylicum</Emphasis> using response surface method

Butanol is a new kind of very potential biofuels.Enzymatic hydrolysis of corn stalk was utilized in this study to produce butanol by Clostridium acetobutylicum CICC 8008.Plackett-Burman (P-B) design and Central Composite Design (CCD) were adopted to screen crucial factors during fermentation as well as the optimization of experimental conditions.The result demonstrated that among the seven factors,namely,Yeast extract,(NH 4) 2 SO 4,KH 2 PO 4,MgSO 4,FeSO 4,CuSO 4 and CaCO 3,only CaCO 3 was selected as the most critical factor.The optimization experiment results for CaCO 3 usage,temperature and reaction time by CCD were determined to be 5.04 g/L,35°C and 70 h,respectively.A corresponding mathematical model was established to predict the fermentation experiment and maximum butanol yield of 6.57 g/L was acquired.The result of verification experiment under the optimum conditions showed that 6.20 g/L was the maximum butanol yield.This demonstrated that statistical method was a powerful tool for the optimization of butanol production from enzymatic hydrolysis of corn stalk.     

大肠杆菌植酸酶appA的融合表达及耐热性研究

提取大肠杆菌(SUGL)基因组DNA,通过PCR方法从基因组扩增得到植酸酶基因ap-pA,测序结果表明该基因的ORF读框包含1440个核苷酸.将该基因重组于大肠杆菌表达载体pET-32a(+)中,导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌BL21(DE3)-pET32a-appA.对表达条件进行了优化,在30℃下,以0.1mmol/L IPTG诱导表达植酸酶,表达量达到10%以上.在37℃,用钒钼酸铵法测定了表达的植酸酶活性为40740.7U/g,同时观察不同加热温度对植酸酶活性的影响程度.发现融合表达的