利用无标记的分子信标及核酸染料SYBR Green Ⅰ检测乙肝病毒

本文以野生型的乙型肝炎病毒(HBV)核酸片段为研究对象,利用无标记的分子信标及核酸染料SYBR Green I,建立了一种高灵敏、高选择性的特定序列核酸检测方法.在优化条件下,目标DNA浓度为4×10-11~400×10-11 mol/L之间时,SYBR Green I的荧光强度(ΔI)与目标DNA的浓度(C)具有良好的线性关系,其拟合的回归方程为ΔI=1.9556 C+31.4659(R2=0.9956),方法检测限(3ζ)为2×10-11 mol/L.该方法操作简单、检测速度快、灵敏度高、重现性好、检出限低.利用该方法,结合不对称PCR技术,实现了对HBV的定量检测.     

基于无标记的核酸适配体荧光生物传感器检测凝血酶

设计了一个简单、通用、基于核酸适配体无标记的高敏感、高专一检测凝血酶的荧光方法。以无标记凝血酶核酸适配体单链DNA为识别元素,Pico Green染料传导互补双链的荧光信号。Pico Green是一种不对称菁,当其单独存在时不产生荧光信号,而当其被吸附到互补的双链DNA上时,可产生很强的荧光信号,但被吸附到单链DNA上时,却无明显的信号改变。基于该性质,将其用于凝血酶的检测。该方法对凝血酶的响应线性范围为1.0×10~(-14)~1.0×10~(-7)mol/L,相关系数(r~2)为0.99,检出限为1.0×10~(-14)mol/L。1.0×10~(-8)mol/L两种干扰物质(牛血清蛋白和细胞色素C)的存在不影响凝血酶的检测,表明该方法对凝血酶具有非常好的专一性。该方法成功应用于对人血清样品的检测,其平均回收率为97%~102%。方法可简单、灵敏、特异性地检测凝血酶,有望用于医学临床诊断等领域。     

基于荧光标记核酸探针及核酸染料SYBR GreenⅠ定量检测单链DNA

建立了同步双色荧光定量检测单链DNA的方法。利用氧化石墨烯将荧光标记核酸探针的荧光猝灭,而当其与待测液中的目标DNA发生杂交反应,生成的双链DNA脱离氧化石墨烯而使得染料荧光得以恢复,同时生成的双链DNA与核酸染料SYBR GreenⅠ结合,使荧光增强。在优化条件下,目标DNA浓度在1×10"10～2×10"9mol/L范围内时,两种荧光染料的荧光强度之和与目标DNA的浓度之间具有良好的线性关系,拟合的回归方程为y=63.388x+9.3862,R2=0.9954,检出限为85 pmol/L。本方法灵敏度高、准确性及选择性好。     

微囊藻属DNA电化学传感器的研制

利用自组装法将巯基修饰的DNA探针与6-巯基-1-己醇(MCH)固定到金电极表面,制备了微囊藻属特定DNA传感器,将该传感器与完全互补的微囊藻DNA序列、完全不互补序列,以及单碱基错配序列进行杂交,以Hoechst 33258为杂交指示剂,应用循环伏安法和线性扫描伏安法研究了该传感器对目标DNA的电化学检测行为.研究表明,当与完全互补DNA杂交后,Hoechst 33258氧化信号有明显的增强.实验对自组装时间、MCH浸泡时间及杂交液离子浓度进行了优化.结果表明,当自组装时间为90 min,MCH浸泡时间为1 h,杂交溶液中NaCl浓度为0.3 mol/L时,电化学信号最好.目标DNA的氧化峰电流值与其浓度在1×10~(-8) ～1×10~(-6) mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为8.1×10~(-9) mol/L.     

基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅(Ⅱ)

利用核酸切割酶(Nicking endonuclease)识别特定DNA双链并切割其中某条单链的性质,构建了基于8-17E脱氧核酶(8-17E DNAzyme)的pb2+荧光循环放大检测方法.pb2+可激活8-17E脱氧核酶水解RNA底物,产生并释放出的单链与分子信标探针( Molecular beacon,MB)杂交,导致其茎环结构被破坏,荧光信号恢复;同时形成含有核酸切割酶Nt.BbvCI识别位点的双链区域.在核酸切割酶Nt.BbvCI的作用下,分子信标探针被切割释放,游离出来的单链可与其它分子信标重新杂交,从而触发下一轮酶切,引起荧光检测信号的循环放大.本方法避免了8-17E脱氧核酶与底物链的修饰,最低可以检测出水溶液中1.0×10-10 mol/L Pb2+,并在2倍浓度的Zn2+,以及5倍浓度的其它干扰金属离子存在的情况下对pb2+显示出良好的选择性.本方法对环境水样中pb2+的标准加样回收率为96.1％～108.0％.     

基于核酸适配体的荧光法检测水胺硫磷和丙溴磷

建立了基于适配体的农药水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法.采用可特异性识别水胺硫磷和丙溴磷、且5 '端标记荧光基团FAM的核酸适配体(F-ssDNA),与3 '末端标记猝灭基团DABCYL的短链序列(Q-ssDNA)互补杂交形成双链结构,荧光基团的荧光被淬灭,荧光信号很弱;此时加入靶分子,特异性结合核酸适配体,引起互补短链序列从双链结构中解离,使适配体荧光信号增强,基于此可实现水胺硫磷、丙溴磷的定量检测.优化后的检测条件为:将终浓度为25 nmol/L F-ssDNA与50 nmol/L Q-ssDNA在25℃孵育20 min,使二者杂交形成双链适配体探针复合物,加入等体积的农药样品孵育60 min,然后检测体系的荧光信号变化值△I.在最佳条件下,△I与水胺硫磷和丙溴磷的浓度均在50～ 500 μmol/L范围内呈线性关系.水胺硫磷的检出限(LOD,3σ)为11.4 μmol/L,相对标准偏差(RSD)为5.8％(n=10);丙溴磷的检出限为14.0 μmol/L,RSD为4.9％(n=l0).用于实际水样中两种农药的检测,加标回收率为85.8％ ～95.3％.     

无标记型核酸适体荧光传感器检测氯霉素的含量

建立了DNA核酸适体检测氯霉素的荧光分析新方法。将前人筛选得到的80bp的氯霉素DNA核酸适体截短至40bp,实验发现截短并不影响核酸适体与氯霉素的结合能力。40bp的DNA核酸适体与另一条互补DNA链形成双链DNA,SYBR Green I荧光染料能插入双链并有强荧光发射,加入氯霉素后,氯霉素能和DNA核酸适体形成稳定的复合物,诱导DNA双链打开,SYBR Green I释放,荧光降低。实验结果显示:在10~200μmol/L范围内,荧光降低百分数和氯霉素之间有良好线性关系,检测限为6μmol/L。     

两种DNA分子同时检测的逻辑门及半加器的构建

本研究利用滴涂法和电沉积法构建了氧化石墨烯/金纳米粒子复合膜修饰电极(GCE/GO/AuNPs),基于目标DNA和探针结合前后探针在电极表面构型的变化导致电化学信号变化,实现对大肠杆菌(E.coli)DNA和沙门氏菌(Sal)DNA的智能识别。以目标物为输入信号,分别以Σ|ΔI|和|ΔIMB/ΔIFc|为输出,构建了"AND"型和"XOR"型DNA分子逻辑门,提出了一种新型的可用于逻辑运算的半加器模型。采用方波伏安法(SWV)检测两种标记探针电流变化值Σ|ΔI|,其与E.coli DNA和Sal DNA浓度的对数值在1.0×10~(-13)~1.0×10~(-8) mol·L~(-1)范围内呈现良好的线性关系,检出限(S/N=3)分别为3.2×10~(-14) mol·L~(-1)和1.7×10~(-14) mol·L~(-1)。     

基于核酸适体构象变化的荧光钾离子检测

噻唑橙(Thiazole orange,TO)在游离状态下几乎没有荧光,但当其与富G的DNA结合后,会产生很强的荧光增强效应。据此,利用TO识别有无钾离子存在时富G序列的构象变化,建立了一种基于核酸适体(Aptamer)构象效应进行钾离子检测的无标记荧光检测方法。在优化实验条件下,钾离子浓度在(1～60)×10-6mol/L和(4～9)×10-4mol/L范围内与荧光强度呈良好的线性关系,检出限(S/N=3)为2.2×10-7mol/L。对Li+、Na+、Ca2+、Mg2+、NH4+5种离子进行对照试验的结果表明,该方法不仅具有较好的灵敏度还具有较好的选择性,且无需对DNA进行标记,成本低,分析速度快。     

姜黄素-La3+-CTMAB-核酸体系的荧光增强效应及其应用

研究了镧离子(La3+)-姜黄素(CU)-十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)-核酸荧光增强体系.建立了测定核酸的新方法.体系的最优条件为:六次甲基四胺(HMTA)-HCl缓冲溶液(pH 5.80)中,1.00× 10-3 mol/L阳离子表面活性剂CTMAB存在下,姜黄素浓度为2.00×10-5 mol/L,La3+的浓度为1.40×10-4 mol/L时,核酸能增强La3+ -CU络合物的荧光强度,而且体系荧光的增强程度与核酸的加入量在一定范围内呈线性关系.fsDNA,ctDNA和yRNA线性范围分别为7.00×10-4～10.00 mg/L,4.00×10-4～10.00 mg/L和7.00×10-4～10.00 mg/L;检出限分别为0.17,0.02和0.14 μg/L.与已报道的核酸的分析方法相比,本方法具有较宽的线性范围和较高的灵敏度.研究表明,核酸对体系荧光的增强源于DNA主链上PO3-4与CU之间的静电结合,以及通过氢键和疏水力进行的沟槽式结合,为探针分子提供了疏水性的微环境,降低了体系的非辐射能量损失,使体系的荧光强度增加.     

适配体-荧光共振能量转移法检测雌二醇

利用核酸适配体特异的分子识别功能以及特定荧光基团之间的能量转移,建立了一种高灵敏度、高选择性测定雌二醇的光谱方法。研究了缓冲溶液的pH值、组成和浓度、核酸浓度、实验温度及响应时间等因素对检测雌二醇的影响。在最优的实验条件下(50 mmol/L BR缓冲溶液(pH 7.4),1.0×10-7mol/L核酸,实验温度45℃,响应时间19 min),体系荧光强度的改变值ΔI与雌二醇浓度的对数lgC呈良好的线性关系(r=0.9953),线性范围为1.0×10-11~5.0×10-9mol/L,检出限达6.0×10-12mol/L(S/N=3)。将本方法用于检测人体尿液中雌二醇的含量,雌二醇的加标回收率为94.0%~103.5%。     

杂交链式反应介导赭曲霉毒素A的比色/荧光双模检测

以赭曲霉毒素A(OTA)为目标物,以二氧化硅纳米颗粒作为载体,负载赭曲霉毒素适配体和HCR引发链(cDNA)杂交的DNA双链,构建了一种比色/荧光双模信号输出的高灵敏检测平台。在最优条件下,荧光信号回归方程为ΔF=1033.78lgc+13652.89,检出限为6.11×10^-14 g/mL;比色信号回归方程为A=0.02587lgc+0.7537,检出限为1.33×10^-13 g/mL。该方法成功应用于实际样品中OTA的检测,为食品安全监测提供了一种新策略。     

基于链置换循环无标记检测端立酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂,SYBRGreen Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针,发夹核酸探针为分子识别探针,基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应,建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA (hTR)的荧光新方法.发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面,嵌插在发夹DNA探针茎部的SG Ⅰ的荧光信号被GO猝灭.当人工合成的目标物(T1)存在时,T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应,由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链.刚性的双链DNA脱离GO表面,导致所嵌插的SG Ⅰ产生较强的荧光信号.基于荧光信号的变化,可定量检测0.2～50 nmoL/L的T1,检出限为90 pmol/L.该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、高特异性且无需标记的荧光新途径.     

基于链置换循环无标记检测端粒酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂, SYBR Green Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针, 发夹核酸探针为分子识别探针, 基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应, 建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA(hTR)的荧光新方法. 发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面, 嵌插在发夹DNA探针茎部的SGⅠ的荧光信号被GO猝灭. 当人工合成的目标物(T1)存在时, T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应, 由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链. 刚性的双链DNA脱离GO表面, 导致所嵌插的SGⅠ产生较强的荧光信号. 基于荧光信号的变化, 可定量检测0.2~50 nmol/L的T1, 检出限为90 pmol/L. 该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、 高特异性且无需标记的荧光新途径.     

分子信标探针荧光法测定慢性粒细胞性白血病相关基因

根据慢性粒细胞性白血病(CML)相关基因b3a2序列设计了一种带有荧光基团和淬灭基团的凸环结构探针(分子信标,MB),研究其与互补目标DNA杂交前后的荧光变化行为,建立了b3a2基因检测的新方法.在最适条件下,得到杂交后溶液荧光强度与本底荧光强度的比值(S/B)和目标DNA 的浓度呈线性关系,r=0.9973,线性范围4.0×10-9～3.2×10-8 mol/L.该方法为实际样品的检测奠定了基础.     

双链荧光核酸适体探针用于蛋白质的简便快速检测

发展了一种基于双链荧光核酸适体(F-Aptamer)探针的简单快速检测蛋白质的分析方法.该双链荧光Aptamer探针由一条带荧光标记的Aptamer探针和带猝灭标记的互补DNA组成,当靶蛋白存在时,能形成比双链荧光Aptamer探针更稳定的F-Aptamer/蛋白质复合物,并发出荧光,从而实现对蛋白质的简便快速检测,检测线性范围为6~100 nmol/L,检出限为6 nmol/L.该方法设计简单,对核酸适体分子的大小和空间结构没有要求,可作为一种通用的基于F-Aptamer识别机理的蛋白质检测方法.     

基于氧化石墨烯作为传感平台的DNA电化学阻抗谱传感器制备

制备了一种基于氧化石墨烯作为传感平台的无标记DNA传感器。探针DNA通过π-π堆积作用固定到氧化石墨烯表面,电化学交流阻抗法作为传感表征及检测技术。当传感器识别目标DNA时,由于形成双链结构,双链DNA离开氧化石墨烯表面,进入溶液,使得电化学阻抗值减小。因此,可以利用杂化前后DNA传感器所展现出阻抗值的差异,实现对目标DNA的定量检测。结果表明:目标DNA浓度在1.0×10-8~1.0×10-12mol/L范围内,阻抗值变化与目标DNA浓度的对数呈线性关系,检出限为3.5×10-13mol/L(S/N=3)。此外,传感器能区分互补单碱基错配、完全错配的DNA序列。     

基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光碎灭性质的核酸检测方法

将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与MoS2纳米片的荧光猝灭性质结合,构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法.首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸(HP1和HP2).由于两条探针核酸具有3'粘性末端,使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解,因而被吸附于MoS2纳米片而猝灭其荧光.当目标DNA存在时,会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应,并将探针核酸降解成大量的不能吸附于MoS2纳米片表面的荧光碎片.在优化条件下,目标DNA浓度在0.5~6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系,检出限为0.28 pmol/L.与单重信号放大技术相比,本方法极大改善了分析灵敏度和检出限,且具有良好的单碱基错配区分能力.     

基于石墨烯和蒽醌-2-磺酸钠的Pb2+核酸适体电化学传感器

构建了一种基于石墨烯(GR)-蒽醌化合物(AQMS)在核酸适体表面层层组装的Pb2+电化学传感器。将修饰有巯基的Pb2+核酸适体(apt)固定在金电极表面,然后利用GR与apt碱基之间的π-π作用,将GR吸附在apt修饰电极表面,并用于电活性分子AQMS的组装和电化学信号的放大。当目标分析物(Pb2+)存在时,Pb2+诱导apt转变为稳定的G-四联体结构,使得GR连同信号分子AQMS从电极表面脱落,电化学信号降低,从而实现对Pb2+的监测。结果表明,传感器对Pb2+具有很好的特异识别性,且Pb2+浓度在5.0×10!10~5.0×10!8mol/L的范围内,AQMS的峰电流变化值(ΔIpa)与Pb2+浓度对数(lgCPb2+)呈现良好的线性关系。根据3σ,计算得检出限达到6.0×10!11mol/L。     

基于石墨烯猝灭及核酸外切酶辅助循环放大适体传感器检测ATP

基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助分析物循环放大原理,结合石墨烯(G)的超高荧光猝灭能力,以三磷酸腺苷(ATP)作为模型分析物,构建了一种新型的荧光探针,实现了ATP的高灵敏检测。两条DNA链各包含一部分ATP适体序列,其中1条DNA链的3'端修饰有荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)。当模型分析物不存在时,两条DNA链通过非共价π-π堆积作用吸附在G表面,导致FITC的荧光猝灭。当目标物ATP存在时,两条DNA链与目标物ATP进行特异性结合,形成一双链夹心结构,随后加入ExoⅢ,由于ExoⅢ可对该双链夹心结构的3'凹陷末端进行逐步水解,释放出目标物ATP和游离的FITC。释放出的目标物ATP可继续进入下一循环,不断产生游离FITC,游离FITC将脱离G表面,从而导致体系的荧光恢复,并且恢复的荧光强度与ATP浓度在0.02~1μmol/L范围内存在良好的线性关系,检出限(S/N=3)为9 nmol/L。