凋亡抑制基因P35对杆状病毒增殖的影响

以野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacali for nica Nuclear Polyhedrosis Virus,Ac     

一个新的杆状病毒凋亡抑制基因的克隆及鉴定

缺失功能性ｐ３５基因的苜蓿尺蠖核形多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）突变体（ｖΔＰ３５Ｋ／ｐｏｌ＋）感染草地夜蛾细胞（Ｓｆ９和Ｓｆ２１）［１］及海灰翅夜蛾细胞（ＳＬ２）［２］时，引起细胞凋亡，从而使病毒的感染流产．我们发现海灰翅夜蛾核形多角体病毒（ＳｌＮＰＶ）...     

杆状病毒p35基因延缓昆虫细胞凋亡

构建了以新霉素抗性基因为筛选标记的带有ｐ３５基因的转移载体ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ，以此载体转染Ｓｆ９细胞，经Ｇ４１８筛选得到染色体上稳定整合质粒ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ的Ｓｆ９细胞，克隆化培养后取名为Ｓｆ９－３５．经细胞原位杂交实验证明，Ｓｆ９－３５细胞的染色体ＤＮＡ上含有ｐ３５基因；经放线菌素Ｄ处理后的细胞核酸电泳检测，证实Ｓｆ９－３５具有抗凋亡特性能够支持凋亡抑制基因缺失的ｖＡｃΔｐ３５病毒复制；发现ｐ３５基因在细胞内组成型表达只能延缓ｖＡｃΔｐ３５感染及放线菌素Ｄ处理诱发的细胞凋亡的过程，而不能完全阻止其诱发的细胞凋亡．     

人脊髓灰质炎病毒感染诱发Vero细胞凋亡的研究

用人脊髓灰质炎病毒分别感染Ｖｅｒｏ细胞和稳定表达ｐ３５基因的Ｖｅｒｏ３５细胞，经细胞核ＤＡＰＩ染色，细胞ＤＮＡ琼脂糖电泳和ＴＤＴ生物素原位标记等方法证实病毒感染的细胞具有典型的凋亡细胞学特征和生物化学特征．实验结果表明人脊髓灰质炎病毒感染Ｖｅｒｏ细胞诱发的细胞死亡能被昆虫杆状病毒凋亡抑制基因ｐ３５抑制，为ＩＣＥ类蛋白水解酶途径的细胞凋亡．     

一个新的调控人类细胞死亡基因的发现

ａｓｙ基因是最近发现的一个凋亡诱发基因［１］,但诱发细胞凋亡的机制仍不清楚为研究ａｓｙ基因诱发凋亡的机制,本文以ＡＳＹ为诱饵蛋白（Ｂａｉｔ）,采用酵母双杂交系统从人肺细胞系（ＷＩ３８）ｃＤＮＡ文库中筛选ＡＳＹ结合蛋白基因从１×１０６个共转化子中,分离鉴定了３个Ｈｉｓ＋ＬａｃＺ＋克隆,其中一个克隆的插入片段与Ｇｅｎｂａｎｋ全序列比较没有发现同源基因,推测为一个新基因,命名为ａｓｙ相互作用蛋白基因ａｓｙｉｐ（ａｓｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）ａｓｙｉｐ基因在人的各种组织中均组成性转…     

p16蛋白对B型流感病毒诱导HeLa细胞凋亡的影响

以流感病毒 B/沪防 93- 1株感染 He L a细胞 ,通过 Hoechst332 5 8荧光染色、琼脂糖凝胶电泳分析检测细胞凋亡 ,并用免疫组化技术测定 p16蛋白的表达 ,探讨 p16蛋白表达对 He L a细胞凋亡的影响 .结果表明 ,B型流感病毒感染 He L a细胞可诱导其凋亡 ,感染 2 4h后 ,细胞凋亡数达 84.5 % ;He L a细胞凋亡伴随 p16蛋白的表达 ,2 4h达高峰 ,阳性率为 49.2 3± 1.70 .研究结果提示 ,B型流感病毒感染诱导 He L a细胞凋亡过程与 p16基因激活相关 ,p16蛋白可能是介导流感病毒诱导细胞凋亡的另一重要途径 .     

粘虫核型多角体病毒p35基因抑制细胞凋亡的功能研究

利用去血清方法建立Ls细胞凋亡的实验体系,证明LsNPV p35基因在Ls细胞中瞬时表达可以抑制Ls细胞由于无血清造成的凋亡,构建了在哺乳动物中高效表达LsNPV p35基因的载体pRc/RSV-L p35,并导入Vero细胞瞬时表达,发现LsNPV p35基因产物也可以抑制Vero细胞由于病毒感造成的凋亡,用含LsNPVp35的质粒与vAcAnb(AcNPV p35基因缺失病毒）DNA共转浸Sf-9细胞,可以使vAcAnhDNA在St-9细胞中形成多角体,并且传代后多角体不扩增,表明LsNPV p35基因与AcNPVp35基因具有功能互补性。     

鸭源H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆、序列分析及原核表达

参照GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计并合成引物,以鸭源H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,利用RT PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18 T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子.测序结果表明HA基因长为1683bp.基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX KG中,与GST融合表达.SDS PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量约为90×103.Western印迹表明表达蛋白具有免疫活性.     

P53蛋白在胃肠道恶性肿瘤切缘组织中表达的临床研究

目的：探讨了以P53蛋白为代表的分子切缘与常规细胞病理切缘的关系以及切除肿瘤各边缘5．0cm的组织是否安全可靠,方法：对49例胃肠道恶性肿瘤的瘤中心组织及肿瘤边缘每隔0．5cm取材至上,下切缘5．0cm处,采用免疫组织化S－P法检测P53蛋白,并对应位点的病理切片相比较,结果：距肿瘤切缘愈远,P53蛋白表达率愈低,P53蛋白阳性表达与细胞病理切缘阳性在各位点上相一致,在胃癌中,上切缘阳性范围不超过2．5cm,下切缘不超过3．0cm;在大肠癌中,上切缘阳性不超过1．0cm,下切缘阳性不超过1．5cm,结论：以P53为代表的分子切缘的概念可补充细胞切缘的概念,两者结合有助于提高病理诊断的准确性和可信度,距胃肠道恶性肿瘤各边缘5．0cm的切缘范围是安全可靠的。     

池蝶蚌细胞色素P450 cDNA及其蛋白的序列分析

在实验室已获得的池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)部分细胞色素P450基因序列的基础上,运用RACE PCR的方法获得池蝶蚌细胞色素CYP基因(定义为Hs-CYP450)的全长cDNA。运用相关生物软件和在线软件对HsCYP450基因序列以及其蛋白的一、二、三级结构进行了初步分析。结果显示,Hs-CYP450基因全长1 809bp,ORF框1 431bp,共编码476个氨基酸;氨基酸组成成分中亮氨酸(Leu)含量最多,约9.5%,而最少的则是色氨酸,仅0.8%;通过疏水性分析显示,该蛋白属亲水性可溶性蛋白;二级结构预测显示该蛋白α螺旋(H)结构含量较多,约占46.22%,并均匀分布在蛋白中;β折叠(E)相对较少,约9.87%左右,多分布在两端。建立的系统进化树结果表明,Hs-CYP450基因序列与其他动物的细胞色素CYP基因有较高的同源性,在众多物种中和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)同源性相对较高。     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌—杆状病毒穿梭系统（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）将一套含有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐＳ６５Ｔ）和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地形成多角体,并在紫外光照射下产生强烈的绿色荧光,以重组病毒感染粉纹夜蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）幼虫后,在阳光下即可看到发射绿色荧光的幼虫,在手提式长波紫外光照射下绿色荧光更为强烈,带绿色荧光的幼虫在昆虫生态学和杆状病毒流行病学等研究领域有广泛的用途     

环加氧酶2基因的原核表达、抗体制备及其在肝癌中的表达

用PCR技术扩增环加氧酶2（COX-2）基因的C末端777bp的片段，插入到pET-28b（＋）中，构建原核表达载体．转入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导产生包涵体形式his-COX-2融合蛋白．用镍离子螫合柱（Ni—NTA）纯化融合蛋白，获得纯度较高的原核表达蛋白．纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，用ELISA及Western blotting分别检测抗体．用此抗体Western blotting检测肝癌组织中的环加氧酶2的表达．ELISA及Western blotting结果显示免疫家兔所得的环加氧酶2抗体具有很高的效价，并能够特异性的识别真核细胞中的环加氧酶2．用此抗体检测肝癌组织中的环加氧酶2的表达．证实肝癌组织中伴随有环加氧酶2的大量表达．同时所得的环加氧酶2抗体具有很高的效价和特异性，为进一步研究环加氧酶2的功能提供了条件。     

温控表达载体的构建及HIV-1p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ 和ｐ Ｅ Ｔ２８,构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐ Ｖ Ｖ５,该载体携带 Ｐｒ Ｐｌ串联温控启动子以及 Ｈｉｓ Ｔａｇ 的纯化标签,利于目的蛋白的表达与纯化将 Ｈ Ｉ Ｖ１ ｇａｇ 基因的１１４８１８５７ 编码序列分别插入到ｐ Ｖ Ｖ５ｂ、ｐ Ｅ Ｔ２８ｂ 的相应位点,构建了重组表达质粒 ｐ Ｅ Ｇ１ｂ、ｐ Ｂ Ｇ７ｂ,二者在不同受体菌中,表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的 ４２％ 和２８％ 表达产物为融合蛋白并主要以包涵体的形式存在 该蛋白 Ｎ 端与含６ 个组氨酸在内的３０ 个氨基酸残基的多肽相连,利用 Ｉ Ｍ Ａ Ｃ金属螯和层析柱,对包涵体中的重组ｐ２４ 蛋白进行纯化, 其纯度超过 ８０％ ;对上清中的可溶性ｐ２４ 蛋白进行纯化,产物最终纯度超过６７％ 纯化后的重组蛋白可与 Ｈ Ｉ Ｖ１ 型标准阳性血清发生较强的免疫学反应     

HGV NS_3 cDNA片段的表达及其免疫原性的研究

一段长度为１３２７ｂｐ的庚型肝炎病毒ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中得到表达．此ｃＤＮＡ被插入到噬粒ｐＧＥＭＤ中,位于编码大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ７０－因子氨基端８个氨基酸残基的ＤＮＡ序列的下游,并与σ７０－因子处于同一阅读框．表达的含有ＨＧＶ蛋白质的融合蛋白达到宿主菌细胞蛋白总量的百分之十．免疫印迹实验证明,此种融合蛋白能被庚型肝炎病人的血清识别     

人t-PA P区在大肠杆菌中表达及其活性研究

用PCR方法获得编码人组织型纤溶酶原激活物（tissure-typeplasminogenactivator,t-PA）C端P区肽段的DNA,并经测序证实,长810bp,含有全部的t-PA的丝氨酸蛋白酶编码序列.将这段序列克隆到表达载体pQE30中转化大肠杆菌JM109菌株,经SDS-PAGE检测转化菌株中表达出分子量约29×103的蛋白,用纤维平板法测定激活纤溶活性,结果表明表达的t-PA蛋白C端P区具有很强的激活纤溶蛋白酶原的活性.证实t-PA蛋白C端P区的酶结构区的功能是独立的,其生物活性不受其它区域影响．     

蝎神经毒素AaIT的表达及功能分析

在不改变氨基酸编码序列的情况下，根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计并人工合成了适合于大肠杆菌表达的蝎神经毒素AaIT基因．将该基因插入到大肠杆菌表达载体PET32a＋中，得到重组质粒PET32a-AaIT，将该质粒转入带有trxB／gor双突变的大肠杆菌Origami（DE3），重组菌株经IPTG诱导后，获得町溶性表达产物，但该表达产物没有生物学活性．把此基因插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC6αA构建重组质粒pPIC6αA-AalT，转化毕赤酵母（X-33），经甲醇诱导后，获得高水平的分泌表达（20mg／L）．表达产物喂食银纹夜蛾及甜菜夜蛾没有表现出生物活性，经注射有活性．