κ-卡拉胶寡糖脂的合成及其结构鉴定

以κ-卡拉胶为原料, 通过稀酸降解并结合柱层析分离得到5个寡糖单体, 经还原胺化法将其与二棕榈酸酯磷脂酰乙醇胺(DPPE)偶联首次获得了5个拟糖脂. 应用高灵敏电喷雾离子化碰撞诱导解离串联质谱(ESI-CID-MS/MS)技术确定了其序列, 证明其分别为κ-卡拉胶三糖脂、五糖脂、七糖脂、九糖脂和十一糖脂. 该研究结果为硫酸寡糖脂的合成提供了参考方法, 尤其为寡糖生物芯片的制备以及深入开展寡糖与蛋白相互作用研究提供了基础.     

杂合褐藻糖胶寡糖的制备及结构分析

采用热水提取法从海蒿子(Sargassum pallidum)中得到一个杂合的褐藻糖胶(SPF); 采用稀酸水解和低压凝胶渗透色谱(LPGPC)分离得到一系列杂合硫酸寡糖. 结合单糖组成、 甲基化和电喷雾碰撞诱导串联质谱(ES-CID-MS/MS)分析表明, 所得21个寡糖属于杂化岩藻寡糖硫酸酯, 主要由α1→3连接的Fuc及少量β1→4连接的Xyl和β1→6连接的Gal组成; 硫酸基取代位点主要存在于Fuc的C4或C2位、 Xyl的C2位和Gal的C4位; Fuc主要存在于寡糖的非还原端. 实验结果表明, ES-CID-MS/MS 技术可用于各种杂合褐藻糖胶寡糖的结构序列分析. 这些结构多样的硫酸寡糖可进一步点印到糖芯片上, 研究其与蛋白相互作用.     

κ-卡拉胶寡糖的反相离子对-超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱研究

建立反相离子对-超高效液相色谱(RPIP-UPLC)和电喷雾离子源-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)联用技术快速分离鉴定硫酸寡糖的方法.以20 mmol/L庚胺(pH 4)为离子对试剂,25%庚胺甲酸盐纯水溶液(A)和25%庚胺甲酸盐甲醇溶液(B)为梯度洗脱溶剂,κ-卡拉胶寡糖通过BEH C18反相柱分离后,分别在正、负离子模式下进行四极杆-飞行时间质谱分析.结果表明,聚合度为3～45的κ-卡拉胶寡糖在BEH C18柱上得到很好的分离,从每一个色谱峰对应的质谱图中可以准确获得直至27糖的各寡糖结构信息,均为奇数糖,与聚丙烯凝胶电泳结果吻合.所得的寡糖断裂规律对卡拉胶寡糖的快速鉴定和结构解析具有重要意义.     

中性人乳寡糖的分离及结构鉴定

以脱脂、除蛋白后的人乳为原料,联合运用阴离子交换色谱(AEC)、凝胶渗透色谱(GPC)和多孔石墨化碳色谱(PGC)等多种分离纯化技术制备了18种中性人乳寡糖,并采用电喷雾碰撞诱导串联质谱(ESI-CIDMS/MS)技术对其结构进行了鉴定.结果表明,所制备的中性人乳寡糖主要为三至九糖,含有半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和岩藻糖(Fuc).所有寡糖的还原端均含有乳糖核心(Galβ1-4Glc),非还原端均含有乳糖胺(Galβ1-3/4GlcNAc),并且Fuc以α1-2,α1-3和α1-4连接于主链的Gal,Glc和GlcNAc上.     

κ-卡拉胶寡糖AEC柱前衍生物的LC-ESI-MS/MSn分离分析

以κ-卡拉胶为原料, 经盐酸水解得到一系列寡糖混合物. 以3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole, AEC)为衍生化试剂, 对酸解得到的κ-卡拉胶寡糖进行柱前衍生, 采用反相C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 乙腈和乙酸铵水溶液(pH 4.5)为流动相, 梯度洗脱, 在254 nm波长处检测, 建立了κ-卡拉胶寡糖衍生物的高效液相色谱(HPLC)分离以及液相色谱-电喷雾质谱联用(LC-ESI-MS)分离分析的方法, 并对AEC衍生后的κ-卡拉胶寡糖进行多级质谱裂解(MSⁿ), 进一步获得了κ-卡拉胶寡糖的结构信息. 该方法对κ-卡拉胶寡糖的结构分析、构效关系等方面的研究有参考价值.     

海带褐藻多糖硫酸酯的降解与岩藻寡糖的制备

采用稀酸水解的方法降解粗褐藻多糖硫酸酯(FPS)制备了硫酸化岩藻寡糖.通过考察降解及沉降条件研究了FPS的水解及沉降规律.通过理化性质分析发现,沉降所得上层清液为杂合硫酸化岩藻寡糖[岩藻糖(Fuc)含量55%].进一步采用Bio-Gel P4低压凝胶渗透色谱分离纯化,得到4种以岩藻糖为主的低聚合度硫酸化寡糖.单糖组成分析和电喷雾质谱(ESI-MS)分析结果表明,各组分主要为系列低聚合度硫酸化岩藻寡糖或硫酸化岩藻糖,包括Fuc_(1~3)S_(1~3),Fuc_(1~2)S_(1~2),Fuc_(1~2)S_1及FucGlcAS.     

系列甘露糖醛酸寡糖的制备与鉴定

用酸降解法制备了系列甘露糖醛酸寡糖(聚合度2～8),并分析测定了寡糖的结构. 褐藻胶经部分酸水解,于pH=2.85处分级获得聚甘露糖醛酸. 继续用酸降解法降解聚甘露糖醛酸,经凝胶柱层析分离纯化,获得系列甘露糖醛酸寡糖. 用荧光标记糖电泳(FACE)对寡糖进行了分析,并用电喷雾离子化质谱(ESI-MS)、 核磁共振波谱(NMR)及红外光谱(FTIR)进行了结构表征. 本研究用酸降解法制备饱和甘露糖醛酸寡糖,用凝胶柱层析法分离获得系列聚合度的寡糖,为褐藻胶大分子构效关系研究和药物的筛选与发现提供了重要的基础资料.     

固相酸解法制备古糖酯寡糖及其电喷雾质谱分析

以褐藻酸中分离的聚古罗糖醛酸(PG)为原料, 以三氧化硫-吡啶为硫酸酯化试剂, 采用正交实验法确定了制备高硫酸酯基取代古糖酯(PGS)的最佳工艺条件, 并采用2D-NMR分析对其结构进行了确证. 本文建立了一种新的环境友好型固相酸解方法以制备PGS的寡糖(即采用732#阳离子交换树脂这种固态酸对PGS进行降解). 结果表明, 当732#阳离子交换树脂用量为200 mg/mL、PGS的质量分数为2%时, 在100 ℃下降解6 h可得到重均分子质量(Mw)小于3000的PGS寡糖, 经Bio-Gel P6凝胶层析柱分离可以得到13个聚合度单一的寡糖组分F1~F13. 电喷雾质谱(ESI-MS)分析结果表明, F1~F13分别是聚合度为1~13的PGS寡糖.     

基于电喷雾串联质谱的蓝藻寡糖脱果糖分析及系列α-1,2-葡聚寡糖的制备

为获得系列α-1,2-葡聚寡糖,首先以蓝藻寡糖六糖、八糖、九糖和十糖为原料,在0.5 mol/L的三氟乙酸(TFA)中于95℃酸解9 min以脱去还原端果糖,经低压凝胶色谱分离纯化,用电喷雾离子化-碰撞诱导解离-串联质谱(ESI-CID-MS/MS)和基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)鉴定和序列表征,获得了除去末端果糖的α-1,2-五、七、八和九糖;然后在0.5 mol/L的TFA中于95℃对混合蓝藻寡糖六糖和八糖酸水解45 min,用Bio-Gel P2凝胶柱对混合物进行分离和纯化,并通过ESI-MS和MALDI-MS对获得的每个寡糖组份进行表征,获得了聚合度为2,3,4和6的α-1,2-葡聚寡糖.本研究为利用糖生物芯片技术进行α-1,2-葡聚寡糖的功能筛选及分析其与靶标蛋白之间相互作用的特异性提供了葡聚寡糖物质基础.     

电喷雾质谱在寡糖序列分析中的应用

选取具有不同结构特征的N-糖链、硫酸软骨素寡糖、人乳寡糖以及海洋来源的壳寡糖、褐藻胶寡糖、卡拉胶寡糖和硫酸岩藻寡糖等,对电喷雾质谱在寡糖的主链序列、分支位点、硫酸基取代位置确定、单糖组成和聚合度分析等方面的应用技术及碎片离子的断裂规律进行了总结.根据相邻同类碎片离子之间的质荷比差值可初步判断寡糖的单糖组成类型;通过与色谱分离技术联用或衍生化方法可提高寡糖的分辨率和离子化效率,并测得寡糖的分子量及聚合度;借助串联质谱及对寡糖还原端的特异性标记,可获得寡糖的还原端残基和部分序列信息;根据寡糖产生的特征碎片离子及其丰度大小可判断残基的特定位置和类型.另外,寡糖的分支通常作为一个整体发生糖苷键断裂或产生D离子,据此可判断分支点的位置;根据硫酸寡糖产生的特异性跨环断裂碎片,可以确定硫酸基的连接位置.这些规律和方法的总结为未知寡糖的结构和序列的分析提供了启发和指导.     

利用糖芯片研究半乳寡糖与蓖麻凝集素和鸡冠刺桐凝集素间的相互作用

建立了用糖芯片技术研究寡糖与凝集素相互作用的方法.以新乳糖-N-四糖(LNnT)、乳糖-N-四糖(LNT)、λ-卡拉胶四糖(L4)和琼胶五糖(A5)为原料,经还原胺化法分别将其与1,2-十六烷基磷脂酰乙醇胺偶联得到拟糖脂,再将其与卵磷脂和胆固醇按4∶2∶5比例混合制备成脂质体后,用全自动芯片点样仪将其点印在硝酸纤维素膜包被的玻片上制成糖芯片,并进行寡糖与凝集素的结合实验.结果表明,蓖麻凝集素(Rieinus communis agglutinin 120,RCA120)特异性识别非还原端糖残基为Galβ(1 →4)的寡糖,而鸡冠刺桐凝集素(Erythrina cristagalli lectin,ECL)特异性识别非还原端糖残基为Galβ(1→4)GlcNAc的LNnT.采用接触式芯片点样仪制备糖芯片,并用荧光扫描仪对糖与凝集素结合信号进行检测,增加了灵敏度和准确性.本方法不仅适合于糖与蛋白相互作用的研究,也有助于加快糖类药物的发现.     

基于ESI-CID-MS/MS离子碎片峰特征的香菇多糖水解机制及系列香菇寡糖的制备

将香菇多糖和0.02 mol/L三氟乙酸(TFA)溶液按照1 mg∶200μL比例混合并于100℃水解,然后利用快速蛋白液相色谱(FPLC)技术对分别水解2,4,6 h的水解产物中不同聚合度寡糖的组成与丰度进行分析,从而确定最佳水解时间;用确定的最佳时间对水解残留多糖重复水解3次,直至多糖沉淀消失为止,然后分别对水解产物进行FPLC分离并依次收集每批次的七糖.对七糖进行ESI-CID-MS/MS分析,结合β-1,3-二糖、七糖及β-1,6-葡聚寡糖二糖的ESI-CID-MS/MS质谱特征,可获得每次水解产物中寡糖的结构信息,进而获得香菇多糖的水解机制;最后用P4凝胶柱对水解产物进行色谱分离,获得具有不同聚合度的全序列寡糖.结果表明,香菇多糖的最佳水解时间为4 h,在不同批次的水解过程中香菇寡糖的结构由β-1,3/1,6-寡糖过渡为纯β-1,3-寡糖.     

含N-乙酰化肝素寡糖的制备及序列分析

建立了含N-乙酰化肝素寡糖的分离提纯及其序列结构分析方法.首先应用肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素来富集含N-乙酰化结构寡糖,通过Bio-Gel P10凝胶色谱法分离制备了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗样品,ProPac PA-1强阴离子高效液相色谱(SAX-HPLC)等方法对粗样品进一步分离,提纯得到4种六糖和3种八糖片段.其次应用肝素酶Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ复合酶解与HPLC法分析各纯化寡糖的二糖组分,并结合肝素酶Ⅰ底物特异性,初步推断4种六糖和3种八糖的序列结构.在寡糖的糖链两端均含有N-硫酸化二糖,而N-乙酰化二糖分布在糖链当中.应用电喷雾离子阱-飞行时间质谱(ESI-IT-TOF-MS)在负离子模式下进一步表征寡糖并分析其裂解规律.结果表明,各寡糖中均出现大量因SO32-丢失形成的碎片离子峰,六糖中主要有双电荷和三电荷碎片离子峰;在八糖中出现了一系列从双电荷至五电荷的离子峰.各寡糖的双电荷离子峰质荷比进一步确定了上述寡糖的序列结构.六糖的裂解规律表明,裂解主要存在于糖苷键,N-乙酰葡糖胺和糖醛酸上的裂解方式分别为0,2X和0,2Z.本研究提供了切实有效的分离、分析未知结构肝素寡糖序列的新方法.     

糖芯片技术研究琼胶寡糖与凝集素RCA120相互作用

以琼胶糖为原料, 通过酸法与酶法降解以及凝胶过滤色谱分离, 获得了9种寡糖. 采用还原胺化法将其与1,2- 二-十六烷基-3-磷脂酰乙醇胺甘油(DHPE)偶联, 获得了相应拟糖脂. 采用糖芯片技术, 通过与标准寡糖(LNnT与LNT)比较, 评价了其与凝集素RCA₁₂₀的相互作用. 首次发现, 酸法水解得到的琼胶寡糖与RCA₁₂₀作用力明显高于LNnT, 表明具有Galβ1,4AnG-R结构类型的寡糖与RCA₁₂₀亲和力强于Galβ1, 4GlcNAc-R, 且亲和力的大小与聚合度无关.     

临床肝素类药物酶解分析二糖组成

肝素是一类结构复杂的高分子糖类,以N-硫酸、6-O硫酸氨基葡萄糖和2-O硫酸艾杜糖醛酸为主要成分组成二糖。常见的肝素注射液是以未分级肝素为原料纯化灭菌制备而来,在临床上使用更为广泛的是将肝素降解得到的低分子片段,低分子肝素保留了肝素糖链基本结构,但是不同制备工艺导致其具有不同的还原及非还原端。本研究以肝素类药物为研究对象,使用肝素裂解酶玉,域及芋将肝素注射液、低分子肝素注射液(达肝素、那屈肝素、依诺肝素)、化学合成的类肝素(磺达肝素)进行酶催化降解产生二糖,结合强阴离子交换色谱( Strong anion exchange high performance liquid chromatography,SAX-HPLC)以及紫外检测器在线分析,使用市售肝素二糖标准品确定各种二糖结构。此外,使用反向离子对色谱和电喷雾质谱联用分析磺达肝素中的甲基二糖以及达肝素和那屈肝素中的脱氨二糖结构,为肝素以及类肝素药物的质量控制提供更为精确的结构信息。     

高效液相色谱-质谱联用法分析3-氨基-9-乙基咔唑柱前衍生化壳寡糖

以3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole, AEC)为衍生化试剂对壳寡糖进行柱前衍生,壳寡糖(COS)的还原端与AEC的伯氨基反应生成烯胺,再被硼氢氰化钠(NaBH3CN)还原为二级胺。采用反相C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),乙腈和乙酸铵水溶液为流动相(pH 4.5),梯度洗脱,在254 nm波长处检测,建立了一套壳寡糖衍生物的高效液相色谱(HPLC)分离分析、电喷雾质谱(ESI-MS)及液相色谱-电喷雾质谱联用(LC-ESI-MS)的分析方法。该方法操作简单、灵敏度高、重复性好,在COS的组分分析、质量控制及构效关系研究方面有潜在的应用价值。     

大肠杆菌O152中wfgD基因编码的β-1,3-葡萄糖基转移酶产物结构的质谱表征

大肠杆菌O152抗原的寡糖重复单位中含葡萄糖-β-1,3-N-乙酰葡萄糖胺(Glc-β-1,3-GlсNAc)连接键。本研究采用电喷雾离子化多级串联质谱技术对以人工合成的天然受体底物的结构类似物苯氧基十一烷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc-β-PO3-PO3-(CH2)11-O-phenyl(GlcNAc-PP-PhU))为受体底物,尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)为给予体底物的酶促反应产物进行了详细的结构表征。电喷雾离子化多级串联质谱图中观察到的主要碎片源于磷酸二酯键部分和糖苷键的裂解。此外,由观察到的二糖产物非还原端碎片获得了序列信息;跨环断裂碎片及源于吡喃环取代基消除的‘内在’碎裂离子可提供组成产物的单糖残基连接方式信息。广泛的碎裂信息表明wfgD基因编码UDP-Glc:GlcNAc-pyrophosphate-lipid中的β-1-3葡萄糖基转移酶。     

肝素非还原端饱和结构的紫外吸收研究及在肝素寡糖测序中的应用

为了进一步探讨非还原端饱和结构的肝素寡糖在UV 232 nm的吸收情况, 制备了4种饱和结构的肝素二糖, 并用离子对反相液相色谱/离子阱飞行时间质谱(RPIP-LC/MS-IT-TOF)光电二极管阵列检测器分析了它们在UV 232 nm的吸收情况. 分析结果表明, 饱和结构的肝素二糖在UV 232 nm的检出限为9 μg(S/N=10), UV 232 nm/UV 206 nm约为不饱和结构肝素二糖UV 232 nm的7%~40%. 结果还表明, 肝素二糖UV 232 nm的吸收强度受亚硫酸基团(SO₃^2?)影响较大. 另外, 通过比较不饱和结构的肝素/硫酸类肝素(Hep/HS)标样二糖发现, 含N-未取代葡萄糖胺(GlcNH₃⁺)基团的二糖在UV 232 nm的吸收值较低. 最后, 通过简单的UV检测方法, 结合 HNO₂(pH=4.0)裂解法和RPIP-LC/MS-IT-TOF分析, 简化了含GlcNH₃⁺肝素六糖的测序方法. 本研究为以后用 HNO₂(pH=1.5)裂解法对混合组分N-硫酸化的肝素寡糖结构序列分析提供了可能.     

唾液酸化人乳寡糖的分离及串联质谱结构序列分析

基于不同唾液酸化寡糖之间的极性、空间结构及电荷密度的差异性,采用半制备型多孔性石墨化碳(PGC)色谱分离制备了高纯度唾液酸化人乳寡糖单体,并使用离线的电喷雾-串联质谱技术(ESI-MSn)确定8种寡糖单体的序列结构分别为6'-SL,3'-SL,LSTb,LSTc,F-LSTc,F-LSTb,DSLNT与FS-LNn H.本文结果为进一步从事唾液酸化人乳寡糖的结构与活性研究提供了参考依据.     

Pronase E酶解释放糖蛋白N-糖链的方法及荧光标记衍生物的LC-MS分析

建立了一种用非特异性酶链酶蛋白酶 E(Pronase E)从糖蛋白上释放N-糖链的方法. 以牛胰核糖核酸酶 B(Ribo B)和鸡白蛋白(Chicken Albumin)为材料, 用Pronase E代替N-糖苷酶 F(PNGase F)释放N-糖链. 当蛋白酶质量与糖蛋白质量比为1∶1时, 得到只带一个天冬氨酸(Asn)的闭环N-糖链, 称其为糖氨酸(glycan-Asn), 这样既为糖链引入了天然的-NH2活性基团, 同时还保持了糖链原有的还原端闭环结构. 以9-氯甲酸芴甲酯(Fmoc-Cl)为衍生试剂对解离后的糖氨酸进行衍生, 采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-ESI/MS)对Fmoc-Cl糖氨酸衍生物进行分析, 建立了糖蛋白的Pronase E酶解、微量糖氨酸的Fmoc-Cl衍生以及糖氨酸衍生物的HPLC-ESI/MS分析方法, 该方法保持了N-糖链的天然结构, 便于以-NH2为功能基团进一步进行荧光标记、分离制备以及糖链与蛋白质的相互作用研究.