双光子荧光探针研究及其应用

双光子荧光显微成像兼具诸如近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等特点而显著地优于单光子荧光显微成像,为生命科学研究提供了更为锐利的工具。而用于像离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面研究的双光子荧光探针,是实现成像的关键。双光子荧光探针的研究旨在促进双光子荧光显微镜应用的发展,促进生命科学、医学科学的快速发展,同时也带动双光子荧光探针所隶属的化学这一学科的发展。因此对双光子荧光探针的研究具有重要的理论和实践意义。该文综述了双光子荧光显微成像的优点、双光子荧光探针设计的原理及双光子荧光探针在离子分析方面的应用,并展望了这类荧光探针的发展趋势与应用前景。     

一种用于细胞核成像的新型双光子荧光探针

本文报道了具有大双光子活性吸收截面的DNA探针BMVEC, 同时首次利用双光子显微镜完成了与DAPI的复染实验, 实验结果证实了BMVEC对细胞核的选择性标记能力.     

双光子生物荧光显微技术中的探针问题

近年来,双光子材料及其相关应用技术的研究引起了人们的广泛关注,并取得了很好的进展。其中,双光子生物荧光显微技术受到了特别重视。本文重点介绍这一技术在生物荧光成像方面的优势,同时深入探讨了该技术面临的缺乏高效双光子荧光探针的问题,总结了双光子荧光探针材料的发展现状和前景。     

双光子荧光探针在生物传感中的应用

荧光探针由于其灵敏度高、选择性好等优势已经成为研究复杂生物系统的有力工具。和单光子荧光探针相比,双光子荧光探针由于其激发光源较大的穿透深度、低的组织自发荧光干扰以及较好的空间选择性在生物传感中发挥着不可替代的重要作用。在本篇综述中,我们从双光子荧光探针的设计原理出发,系统全面地介绍了双光子荧光探针在金属离子、细胞微环境、活性物质(包含活性氧、活性氮、活性硫)、酶和亚细胞器(线粒体、溶酶体)等检测中的应用研究。在此之后,展望了有机双光子荧光探针在开发和应用方面尚待科学界解决的关键机遇和挑战。     

双氰基二苯代乙烯型双光子荧光汞离子探针

分别以双氰基二苯代乙烯(DCS)和双[2-(2-羟乙基硫基)乙基]氨(HSA)为双光子荧光团和汞离子受体,合成了双光子荧光汞离子探针(DHg),并对其结构进行了分析.实验结果表明,DHg在甲苯、乙腈和水中的荧光量子产率(Φ)分别为0.78,0.42和0.20,对汞离子的络合常数通过单、双光子荧光滴定分别拟合为lg K=5.47±0.02和lg K=5.34±0.02.DHg在水溶液中对汞离子具有优良的选择性和高的灵敏性,可用于中性环境中汞离子的检测.DHg的双光子吸收截面(δTPA)在水溶液中高达840 GM,可用于细胞中汞离子的检测与成像.     

一个新的具有双光子诱导荧光测量能力的在水中对铅离子有选择性的荧光探针

报道了一个对Pb^2＋具有很好选择性的探针1,其荧光团部分为：1,4-二氰基-2,5-联（苯乙烯基）苯;配体为：[（2-羧基甲氧基-苯基）-羧基甲基-胺基]-乙酸．在探针1的水溶液中滴加铅离子,它的荧光发射光谱发生变化,在590nm处出现一个新的宽带峰．探针1在生理环境的pH范围内不受pH的影响,并且在740nm,它的双光子吸收截面为最大：51GM．     

细胞内铜离子的双光子荧光成像

基于无荧光的螺环结构与具有荧光的开环酰胺的平衡反应,本文合成了一个能在水基的缓冲溶液中选择性地识别Cu²⁺的罗丹明衍生物FD2.当在HEPES缓冲溶液中加入10当量的Cu²⁺时,FD2的单光子激发荧光和双光子激发荧光的强度均表现出明显的增强;更为重要的是,运用双光子荧光显微技术可以选择性地对活细胞内Cu²⁺进行成像.     

1,3,4-噁二唑衍生物的双光子吸收和双光子泵浦荧光

依据“推电子基-共轭中心-拉电子基-共轭中心-推电子基”的模型将电荷传输型1,3,4-噁二唑环嵌入芳香共轭体中, 通过Wittig-Horner反应合成了2种对称型强双光子吸收和双光子诱导荧光分子2,5-二[4-(2-芳基乙烯基)苯基]-1,3,4-噁二唑. 它们的氯仿溶液在锁模Nd: YAG激光器800 nm激光照射下, 发射出很强的双光子上转换荧光, 其最强荧光分别在波长507和475 nm. 采用非线性透过率法测得其双光子吸收截面分别为1.07×10^－46和6.6×10^－47 cm⁴•s•photon^－1. 这2个对称型D-π-A-π-D生色分子从激发端基到π共轭桥的有效能量传输, 对双光子吸收和双光子荧光发射能力贡献较大.     

用于细胞核成像的2,7-BHVC双光子荧光探针

分别合成了2,7-双(1-羟乙基-4-乙烯基吡啶) 咔唑碘盐(2,7-BHVC)与3,6-BHVC, 进行了荧光性能和细胞核成像测试, 结果表明, 2,7位的Ф×δ是3,6位的2.8~3.6倍, 染色实验也证实了2,7-BHVC有特定成像细胞核的能力.     

衍生于双氰基二苯代乙烯的用于活体成像的双光子荧光锌离子探针

制备了衍生于双氰基二苯代乙烯的双光子荧光锌离子探针, 该探针以4-(2-吡啶甲基)哌嗪为锌离子受体, 当络合锌离子时, 探针的荧光强度增强了72.5倍和580 GM的双光子吸收截面. 该探针无细胞毒性且在体内环境中无pH敏感性, 其解离常数\begin{array}{c}{K}_d^{\mathit{TP}}\end{array}=(0.52±0.01) μmol/L. 性能测试结果表明, 该探针能选择性地检测活细胞中的游离锌离子, 耐时长达约1500 s, 且能探测活体组织80~150 μm深处的锌离子, 不受其它金属离子与生物膜的干扰.     

Novel Lipophilic Fluorophores with Highly Acidity-Dependent Two-Photon Response

Lipophilic fluorophores are widely implemented in nonlinear microscopy; however, few existing membrane-specific probes combine the high brightness of two-photon excited fluorescence (2PEF) with pH sensitivity. Herein we describe four novel two-photon excited fluorophores, based on a coumarin 151 core structure, where lipophilicity is induced by a covalently attached phosphazene moiety. Changing the environmental acidity using trifluoromethanesulfonic (triflic) acid leads to profound changes in the linear fluorescence and 2PEF characteristics, due to chromophores’ switching between neutral- and protonated forms. We characterize this dependence by measuring the two-photon absorption (2PA) spectra over the region λ_2PA=550–1000 nm, observing 2PA cross sections of σ_2PA=10–20 GM, with an associated 2PEF brightness of 10–13 GM, in neutral solutions of both acetonitrile and n-octanol. Although quantum chemical modelling and NMR measurements show that, at high chromophore concentrations, protonation may be accompanied by a dimerization process, these dimers likely do not form at the lower concentrations used in optical spectroscopy.     

Multipolar Porphyrin-Triazatruxene Arrays for Two-Photon Fluorescence Cell Imaging

Two-photon excited fluorescent (TPEF) materials are highly desirable for bioimaging applications owing to their unique characteristics of deep-tissue penetration and high spatiotemporal resolution. Herein, by connecting one, two, or three electron-deficient zinc porphyrin units to an electron-rich triazatruxene core via ethynyl π-bridges, conjugated multipolar molecules TAT-(ZnP) _n (n=1–3) were developed as TPEF materials for cell imaging. The three new dyes present high fluorescence quantum yields (0.40–0.47) and rationally improved two-photon absorption (TPA) properties. In particular, the peak TPA cross section of TAT-ZnP (436 GM) is significantly larger than that of the ZnP reference (59 GM). The δ_TPA values of TAT-(ZnP)₂ and TAT-(ZnP)₃ further increase to 1031 and up to 1496 GM, respectively, indicating the effect of incorporated ZnP units on the TPA properties. The substantial improvement of the TPEF properties is attributed to the formation of π-conjugated quadrapole/octupole molecules and the extension of D -π-A-D systems, which has been rationalized by density function theory (DFT) calculations. Moreover, all of the three new dyes display good biocompatibility and preferential targeting ability toward cytomembrane, thus can be superior candidates for TPEF imaging of living cells. Overall, this work demonstrated a promising strategy for the development of porphyrin-based TPEF materials by the construction and extension of D -π-A-D multipolar array.     

嘧啶基双光子荧光染料的设计合成与生物成像

生理条件下光学性质稳定的双光子荧光染料在生物成像领域具有广阔的应用前景。我们使用2,4-二甲基-6-羟基嘧啶与4-(N,N-二甲氨基)苯甲醛进行缩合反应,设计合成了具有双光子荧光性质的化合物2-[(1E)-2-[4-(二甲氨基)苯基]乙烯基]-6-甲基-4(3H)-嘧啶(NHP)。通过质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)、紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱等技术手段表征了其结构,研究了其光物理性质,以及外部环境改变对其发射光谱的影响。结果表明,化合物NHP的最佳吸收峰位于400 nm,最佳发射峰位于540 nm左右,且荧光发射不受金属离子、氨基酸和pH等环境因素的影响。生物实验结果表明,化合物NHP细胞毒性较小,且具有很好的活细胞和果蝇脑组织成像效果,是一种较为理想的双光子荧光生物成像染料。     

New Thiophene Derivatives with Two-photon Excited Fluorescence

Organic molecules that can simultaneously absorb two or more photons in reaching theirexcited states have recently been the subject in various photon-electronic fields. Tomeet the criteria for various nonlinear optical applications, such as three-dimensionaloptical storage1 and up-converted lasing2, molecules with large two-photon absorption(TPA) cross-section σ are required and have been synthesized. These dyes generallybelong to the structural modes of D-π-D, A-π-A3 or D-π-A, where D…     

二噻吩衍生物的合成及其线性、非线性光谱性质

合成了一系列二噻吩衍生物类有机合物：5，5'-二（对－N，N－二甲胺基苯乙 烯基）－2，2'－二噻吩（BMSBT）与5，5'－二（对－N，N－二乙胺基苯乙烯基）- 2,2'-二噻吩（BESBT），5,5'-二（对N－环丁胺基苯乙烯基）－2,2'－二噻吩（ BBSBT），5,5－二（对－N－咔唑基苯乙烯基）2-2'－二噻吩（BCSBT），并测定了 其吸收光谱、单光子荧光光谱和双光子荧光光谱。BMSBT，BESBT和BBSBT的单光子 荧光参数存在的很强的、规则的溶剂效应，表明其激发态的分子可能有较大的极性 。在800nm fs激光下测得BMSBT与BESBT在560nm附近（与单光子荧光发射峰波长接 近的位置）有较强的上转换荧光发射，上转换荧光强度与激发能量之间较好的平方 关系表明了双光子激发的机理，这种上转换荧光被称为双光子荧光。用以光子荧光 法测得BMSBT和BESBT的双光子吸收截面分别为54*10~(-50)(cm~4·s)/photon和 102*10~(-50)(cm~4·s)/photon。     

Two—photon Excited Fluorescence of Bithiophene Derivatives

Two new bithiophene derivatives named as 5,5‘‘-bis(p-N,N-dimethylaminostyryl)-2,2‘-bithiophene (BMSBT),and 5,5‘-bis(p-N,N-diethylaminostyryl)-2,2‘-bithiophene (BESBT) have been synthesized.Both compounds can emit strong single-photon excited fluorescence (SPEF) and two-photon excited fluorescence (TPEF) with the emission peaks around-560nm and with the lifetime of-1ns.     

9-戊基咔唑-3,6-双-(炔苯基-4-甲酸乙酯)的合成与双光子特性研究

采用钯催化的碳碳偶合反应合成了9-戊基咔唑-3,6-双-(炔苯基-4-甲酸乙酯)(I).进一步研究了化合物I在四氢呋喃和40%四氢呋喃水溶液中的光物理性质,结果显示,化合物I在40%四氢呋喃水溶液中的紫外吸收峰位置与其四氢呋喃溶液相比没有发生明显移动,它在40%四氢呋喃水溶液中的单光子荧光发射峰出现在453 nm,较其在四氢呋喃溶液的发射有42 nm红移,其荧光量子效率为0.44.用波长为660 nm飞秒激光激发时,化合物I在40%四氢呋喃水溶液中的双光子荧光发射最大峰红移至489 nm,其双光子吸收截面值为251GM,比其在四氢呋喃溶液中的截面(151 GM)增强了60%.