猪瘟病毒NS3蛋白的原核表达纯化和抗体制备

以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.     

浙江省患病凡纳对虾副溶血弧菌的分离、鉴定及毒力基因分析

对浙江省发病凡纳对虾进行了弧菌分离、鉴定, 对分离菌株进行了API-20E生化鉴定, 不耐热毒素基因tlh、致病基因tdh、trh和毒力基因pir的PCR检测, 以及高致病性副溶血弧菌对小鼠致病性研究结果显示, 150个分离菌株中共检出tlh基因菌株61株(40.67%), ap阳性菌株21株(14.00%); 189个固定样品中检出副溶血弧菌阳性样品108个(57.14%), ap阳性样品24个(12.70%); 所有tlh阳性样品中均未检出tdh、trh毒力基因; ap阳性副溶血弧菌灌胃小鼠死亡率为20%, 且其培养上清液有弱溶血效价. 表明副溶血弧菌在浙江省凡纳对虾弧菌感染中占有重要地位, 高致病性副溶血弧菌在副溶血弧菌中占较高比例, ap阳性副溶血弧菌对小鼠具有一定毒力和溶血性.     

对虾肽Penaeidin-2在大肠杆菌中的融合表达及其抗细菌活性

采集南美白对虾血淋巴,从血细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码penaeidin-2成熟肽的开放阅读框cDNA序列,将其克隆至pGEM-T载体,进行序列测定,然后克隆至pET-32a(+)表达载体中,在E.coliOriga-mi B(DE3)pLysS中表达含6个His的重组对虾肽融合蛋白Pen-24,通过His Band resin Ni2+层析柱纯化获得Pen-24蛋白,采用纸片扩散法和液体生长抑制法检测该蛋白的抑菌活性.经SDS-PAGE分析,Pen-24蛋白的分子量为24.1×103.1μg对虾肽融合蛋白Pen-24与5 U的氨苄青霉素活性相当,对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和抗氨苄青霉素大肠杆菌均具有抑菌活性.     

鸭源H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆、序列分析及原核表达

参照GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计并合成引物,以鸭源H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,利用RT PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18 T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子.测序结果表明HA基因长为1683bp.基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX KG中,与GST融合表达.SDS PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量约为90×103.Western印迹表明表达蛋白具有免疫活性.     

蛋白A-藻蓝蛋白β亚基融合蛋白的性质及应用

PCR扩增金黄色葡萄球菌蛋白A基因spa,通过酶切位点的转换构建重组质粒pET-spa,进一步成功构建能表达融合蛋白SPA-CpcB的质粒pET-spa-cpcB.将重组质粒pET-spa-cpcB与在大肠杆菌内生成藻胆色素必需的质粒,以及藻胆蛋白裂合酶质粒,共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,生物合成融合色素蛋白.蛋白质电泳以及锌染色结果表明,体内重组分别获得了融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB.吸收光谱与荧光光谱结果表明,融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB具有与CpcB-PCB或CpcB-PEB相同的光谱特征.将SPA-CpcB-PEB与生物素标记的兔抗体进行荧光免疫反应,通过多功能微孔板荧光检测仪检测,结果表明融合色素蛋白SPA-CpcB-PEB具有SPA能与多种哺乳动物血清中的IgG的Fc段结合的特点.利用SPA-CpcB-PEB来检测包被于聚苯乙烯微量反应板的基因编码为all5292的蛋白,证实了该融合色素蛋白可用于免疫检测.     

PCR技术检测海运船舶压载水病原弧菌初探

船舶压载水引起的外来物种入侵,及由此引发的经济、环境和卫生等方面的灾害性后果,已成为当前世界海洋所面临的最大威胁之一.弧菌作为一种广泛存在于海洋环境的病原微生物,其数量已成为船舶压载水是否可以排放的一项指标.本文采用PCR扩增病原弧菌特征基因技术,结合弧菌相关16S rRNA基因文库,初步探讨压载水中病原弧菌快速检测技术.从采集自舟山远洋船舶压载水水样S1中,检测到hlyA和vvh基因,表明样品中含有霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和创伤弧菌(V.vulnificus)的毒力基因.文库序列分析结果显示,重组克隆子中部分序列与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和费氏弧菌(V.fischeri)相似性较高.研究结果表明,压载水样品S1中含有多种对人和动植物有害的病原弧菌,对海洋生态平衡、公共卫生安全和海洋养殖业具有潜在危害.     

一种新的烟草钙调素结合蛋白的分离鉴定

用^35S标记的钙调素(^35S-CaM)作探针，从烟草cDNA文库中筛选到一个cDNA克隆pTCB40．DNA测序表明，分离的cDNA片段具有的开放阅读框编码233个氨基酸的多肽链．所编码钙调素结合蛋白TCB40(CaM—binding protein，CaMBP)与离子通道蛋白的同源性高达81％．凝胶覆盖实验结果证明其表达的蛋白具有依赖Ca^2 的钙调素结合活性。缺失分析表明钙调素结合位点于其蛋白的C端。Northern blot分析发现，TCB40在烟草茎，叶和花中均表达，但在叶中的表达量明显高于其他器官。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2在病毒包装中的作用

丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒,是导致慢性肝炎的主要病原体之一.近年体外培养体系成功构建后HCV分子生物学的研究获得重要进展,HCV生活周期的各个步骤得到了深入研究.由于NS2蛋白既不是病毒粒子结构成分又不是病毒RNA复制必需成分,因此,近年有较多研究关注于NS2对病毒包装的影响.突变分析表明,NS2蛋白的N端保守位点及跨膜结构对病毒包装至关重要,C端蛋白酶蛋白酶结构域而非其蛋白酶活性为病毒包装所需.此外,NS2蛋白与病毒结构蛋白,非结构蛋白以及多种宿主因子存在相互作用,并在病毒包装过程中形成多种复合体,本文对这些研究进行了归纳总结.     

重组tPA及其突变体纤溶活性的比较

将重组基因rtPA及其突变体rtPAm分别克隆到原核表达载体pET his上,通过平板筛选,双酶切和PCR鉴定获得阳性克隆子,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3).经IPTG诱导,表达出的两种tPA蛋白都形成不可溶的包涵体.SDS PAGE结果显示两种tPA蛋白分子量为4.0×104左右,表达产量较高.包涵体经尿素变性,透析复性后柱层析纯化,纤溶平板法测定激活纤溶蛋白酶的活性,结果显示rtPAm比活性比rtPA高70%左右.     

人γ干扰素 /β 肿瘤坏死因子融合蛋白 His6融合表达及一步纯化

将人 V干扰素 /U肿瘤坏死因子融合蛋白 (hVTNF-U )重组基因克隆于表达载体 pET28,构建成 T7 lac启动子控制下的 His6融合表达质粒 ,转化溶源菌 E. coli BL21( DE3).经 IPTG(1mM )诱导表达 , 阳性菌在 SDS-PAGE泳图上出现一条粗表达带 ,其分子量 (32kDa) 与目的蛋白 H is6-V TN F-U ) 理论分 子量相符. 薄层扫描与溶解性分析显示 ,表达产物占菌体总蛋白的 45% 以上 ,主要为不溶性的包涵体 ( IBs).离心分离 IBs产物 ,溶于 7M尿素中 ,然后通过 Ni柱进行亲和层析 ,即可获得一步纯化的表达产物 (纯度为 96%、回收率为 91% ).纯化产物再经复性缓冲液稀释复性 ,其细胞毒比活性与抗病毒比活性分 别达到 1. 2× 10 7～ 2. 0× 107u /mgp和 6. 6× 10 5 ～ 7. 2× 105 u/mgp.     

人t-PA P区在大肠杆菌中表达及其活性研究

用PCR方法获得编码人组织型纤溶酶原激活物（tissure-typeplasminogenactivator,t-PA）C端P区肽段的DNA,并经测序证实,长810bp,含有全部的t-PA的丝氨酸蛋白酶编码序列.将这段序列克隆到表达载体pQE30中转化大肠杆菌JM109菌株,经SDS-PAGE检测转化菌株中表达出分子量约29×103的蛋白,用纤维平板法测定激活纤溶活性,结果表明表达的t-PA蛋白C端P区具有很强的激活纤溶蛋白酶原的活性.证实t-PA蛋白C端P区的酶结构区的功能是独立的,其生物活性不受其它区域影响．     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

墨胸胡蜂毒腺基因cDNA文库的构建及鉴定

从墨胸胡蜂毒腺中提取总RNA，经Oligo(dT)磁珠纯化mRNA后，用AMV反转录酶合成第一链cDNA．完成第二链cDNA合成后，过柱纯化50bp以上的片段，与载体pUC118连接，转化E．coli JM109，建立了cDNA文库．得到的780个阳性克隆中，重组率达到98．5％．大部分插入片段在500～900bp．随机挑选10个短序列测序，一个为蜂毒激肽基因序列．     

鹌鹑和黑斑蛙核糖体蛋白L15 cDNA片段的克隆和序列分析

通过R-PCR方法、分别从两栖类的黑斑蛙(Rana nigromaculata)和鸟类的鹌鹑(Coturnix coturnix japonica)中首次克隆了核糖体大亚基蛋白Ll5(RPL15ribosomal protein L15)的cDNA片段,并分析了其序列特征,黑斑蛙和鹌鹑的rpll5cDNA片段分别为467个核苷酸和408个核苷酸，推测分别编码155个氨基酸和136个氨基酸的蛋白片段，与其它已知的脊椎动物，rpl15序列有高度的同源性．应用这两条cDNA序列和其它已知的脊椎动物rpll5序列构建的系统发育树显示聚类结果与传统分类一致。     

小鼠卵透明带3(mZP3)cDNA的克隆、测序及mZP3 DNA疫苗的构建

卵透明带3（ZP3）蛋白是透明带中的一种主要蛋白，在精卵结合过程中作为精子的初级受体起重要的作用，抗ZP3抗体可以阻断精卵的相互作用，ZP3被认为是一种潜在的避孕疫苗的靶抗原，本文根据小鼠卵透明带（mZP3)cDNA序列（1317bp）设计了上游和下游引物，从小鼠卵巢中提取总RNA，经RT－PCR克隆了鼠卵透明带3基因的cDNA，将其亚克隆至pUCm-T载体后利用蓝白斑特性筛选出阳性克隆，酶切鉴定后测序比较，与Gene Bank小鼠ZP3 cDNA序列完全相同，证明克隆出正确的小鼠ZP3 cDNA。将mZP3克隆至真核表达质粒pCMV4上，构建完成了DNA避孕疫苗的载体pCMV4-mZP3，为应用DNA疫苗免疫小鼠达到控制鼠害的研究奠定了基础。     

黑虎虾Crustin的克隆表达纯化及抑菌活性测定

从黑虎虾血淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码Crustin成熟肽的cDNA序列,将其克隆至pMD18-T载体进行扩增,然后克隆到pET-32a(+)表达载体中,转化至E.coliOrigamiTM(DE3)中表达Crustin抗菌蛋白,后通过Ni2+亲和层析柱纯化获得Crustin蛋白,采用滤纸片扩散法检测该蛋白的抑菌活性     

绿色杜氏藻GGR基因生物信息学分析及表达研究

采用Illumina HiSeqTM 2000高通量测序方法获得绿色杜氏藻GGR基因(GenBank序号: KX100480) cDNA全长序列, 研究了甲基茉莉酸(MeJA)对绿色杜氏藻GGR基因表达的影响. 测序结果表明, 绿色杜氏藻GGR基因cDNA全长2356bp, 开放阅读框1539bp, 编码512个氨基酸, 分子量为52.2961kDa, 理论等电点为6.54. 序列分析结果表明, 该蛋白具有保守的ChlP结构域, 为可溶性蛋白, 具有跨膜区域, 无信号肽. TargetP 1.1 Server预测结果表明, 该蛋白可能定位于线粒体. 系统进化树结果表明, 绿色杜氏藻GGR蛋白较其他植物的GGR蛋白亲缘关系较 远. RT-PCR结果表明, 100?mol·L-1 MeJA可显著地提升绿色杜氏藻GGR基因的表达(P<0.01). 同时, 绿色杜氏藻叶绿素和类胡萝卜素含量达到最高, 说明GGR基因与绿色杜氏藻叶绿素和类胡萝卜素的合成存在一定关系