表达结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白

利用大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pDE22,构建能够表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, M.s）。采用聚合酶链反应（PCR）方法,从MTB H37Rv基因组DNA中扩增MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段并克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后分别亚克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pDE22,将重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿孔导入M.s,42℃热诱导表达目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot分析。利用PCR方法扩增获得MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段,大小分别为435bp和480bp,基因测序与Genebank公布的基因序列完全一致。SDS-PAGE分析结果表明重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿导入M.s后能够特异性表达目的蛋白,大小约为35kDa,与理论值相符。Western-blot鉴定结果表明抗Rv2031c和抗Rv2626c的单克隆抗体均能够与目的蛋白发生特异性的反应,大小相一致。成功构建表达MTB休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组M.s,并命名为Rv2031c-Rv2626c-rM.s,为其用于结核新型疫苗的研究奠定了基础。     

小鼠结核分枝杆菌感染模型用于评价重组HBHA疫苗免疫效果的实验研究

目的通过复制小鼠结核病模型评价重组HBHA疫苗的免疫效果。方法将重组肝素结合血凝素(HBHA)疫苗接种BALB/c小鼠,观察其诱导的细胞免疫应答水平,并以MTB H37Rv毒株攻击免疫小鼠,研究重组疫苗诱导的保护力。结果重组HBHA免疫BALB/c小鼠后可诱发细胞毒作用,将体内MTB裂解。重组疫苗不仅能刺激CD4+T,CD8+T增殖、活化,还可诱导脾细胞分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子。H37Rv毒株攻击后,被免疫小鼠的组织病理学症状减轻。结论本研究通过检测小鼠体内细胞免疫应答和肺脏组织病理学改变等指标,客观的反映了重组疫苗免疫小鼠结核模型的保护效果。     

结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849免疫学特性的初步检测

探讨了结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849作为药泵蛋白的转运功能及其作为外源蛋白免疫诱导C57BL/6小鼠产生免疫应答的能力.从H37Rv基因组中扩增获得Rv0849基因,酶切后连接到分枝杆菌穿梭质粒pMV261上构建重组质粒pMV0849,并以耻垢分枝杆菌为载体构建获得重组菌株SM(0849).检测药物对重组菌株SM(0849)的最小抑菌浓度(MIC)变化,用重组菌株免疫C57BL/6小鼠检测其作为外源蛋白免疫诱导小鼠产生的免疫应答反应.结果表明,重组菌株SM(0849)对药物的耐受性没有明显提高,但能够较早、较好地诱导小鼠体液免疫应答水平,并能通过刺激小鼠脾脏淋巴细胞促使其分泌高水平的肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ.Rv0849所编码的蛋白具有较弱的药泵功能,但有潜力成为一种新的免疫抗原.     

结核分枝杆菌对感染小鼠肺泡巨噬细胞转铁蛋白受体和铁蛋白表达的影响

探讨不同毒力结核分枝杆菌感染对小鼠肺泡巨噬细胞转铁蛋白受体(TfR)和铁蛋白(Fn)表达的影响及其时相性变化。利用制备的卡介苗(以下简称BCG)和结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株(以下简称H37Rv株)悬液,分别经小鼠尾静脉注射,建立各组小鼠感染模型,各组小鼠感染模型建立成功后,分别于第1、3、5、7、9、11、13、15天,进行各组小鼠肺泡灌洗,收集小鼠肺泡灌洗液,获取各组小鼠肺泡巨噬细胞。应用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR和Fn的表达。利用ELISA方法检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR的表达结果显示:H37RV组与BCG组小鼠肺泡巨噬细胞TfR表达均高于空白对照组,在感染第7、9、11天差异最明显,具有统计学意义(P0.05)。利用Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR表达结果显示:于模型建成后第7、9、11天,H37RN组、BCG组、空白对照组三组之间差异有统计学意义(P0.05)。用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达结果显示:于模型建成后第7、9、11天,H37RV组与BCG组的小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达量明显减低,并且于第7天时表达量最第,异有统计学意义(P0.05)。结核分枝杆菌感染小鼠,导致小鼠肺泡巨噬细胞TfR的表达增高,而Fn的表达降低。不同毒力的结核杆菌感染后Fn蛋白表达差异并不明显,而不同毒力的结核杆菌感染后TfR蛋白的表达有差异性。     

MSMEG0372基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌的构建与鉴定

目的 为研究MSMEG＿0372基因的功能,构建该基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)并鉴定。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增MSMEG＿0372基因的左、右臂(即等位基因互换底物,allele exchange substrates, AES)。AES与p0004s经过酶切并连接,构建p0004s-AES质粒。p0004s-AES与phAE159经过酶切并连接,构建phAE159-AES噬菌粒。噬菌粒转化至M.smegmatis,30℃培养,扩增重组噬菌体。用重组噬菌体侵染M.smegmatis,37℃培养,发生基因同源重组,形成MSMEG＿0372基因敲除菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。PCR扩增MSMEG＿0372基因,构建pMV361-MSMEG＿0372质粒。将pMV361-MSMEG＿0372质粒分别导入MSMEG＿0372基因敲除菌株和野生型M.smegmatis,构建MSMEG＿0372基因回补菌株和MSMEG＿0372基因过表达菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。结果 PCR扩增出MSMEG＿0372...     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

分枝杆菌重组疫苗rBCG-Sj26GST对小鼠的保护作用

为了研究分枝杆菌重组疫苗rBCG-Sj26GST对小鼠的保护作用,用分枝杆菌重组疫苗rBCG-Sj26GST免疫雄性BALB/c,结核杆菌H37Ra进行攻击,检测小鼠淋巴细胞刺激指数(SI),腹腔巨噬细胞培养上清释放NO量,小鼠血清IFN-γ、IL-2的含量,并计数小鼠肝、肺活细菌数.rBCG-Sj26GST疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞刺激指数(SI)为4.12±1.11,与对照组(2.63±0.47)、载体组(1.06±0.08)和BCG组(1.50± 0.41)相比,差异具有显著意义(P＜0.05);rBCG-Sj26GST组巨噬细胞释放的NO量明显高于对照组(P＜ 0.05).小鼠血清IFN-γ的浓度较对照组高33?%,但差异无显著意义(P＞0.05);与载体组相比,差异具有显著意义(P＜0.05).血清白介素-2的浓度较对照组高43?%,较载体组高38?%,但差异无显著意义(P＞ 0.05).经rBCG-Sj26GST免疫的小鼠受结核杆菌攻击后其肺、肝脏结核菌数较对照组少.分枝杆菌重组疫苗rBCG-Sj26GST免疫小鼠后能提高小鼠淋巴细胞刺激指数,刺激IFN-γ、IL-2的分泌,说明此疫苗能诱导CD+4Th1和CD+8CTL的细胞免疫反应,增强小鼠细胞免疫功能,并使小鼠能抵抗结核杆菌的攻击.     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白稳定表达细胞系的建立

建立了能够稳定表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白的P815细胞系。将Ag85B和ESAT6基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3,构建了Ag85B—ESAT6融合蛋白的真核表达质粒Ag85B-pcDNA3-ESAT6。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815（H-2^4）细胞。通过G418压力筛选后,得到1株阳性克隆细胞。经过RT-PCR检测到该细胞中有Ag85B-ESAT6融合蛋白mRNA表达,用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的P815细胞膜上检测到较强的绿色荧光,证实P815细胞内有融合蛋白的表达。获得表达Ag85B-ESAT6融合蛋白的稳定细胞系。     

不同毒力的结核分枝杆菌感染巨噬细胞TfR与Lf的表达

为探讨结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株(BCG)分别感染巨噬细胞,检测细胞内转铁蛋白受体和乳铁蛋白表达量并分析其时相性变化及意义。分别采用结核分枝杆菌H37Rv株和BCG菌株感染巨噬细胞RAW264.7细胞株,于感染后1、6、12、18、24h,应用ELISA技术检测巨噬细胞上清液中TfR和Lf的表达量;应用Western blot技术于上述时间点检测巨噬细胞内TfR的表达量。结果显示,ELISA和Western blot技术均证实感染模型组检测的TfR表达量均高于正常对照组,ELISA结果显示上清液中TfR表达量在感染12和18h差异最明显,具有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示:于模型建成后1、6、18h、差异有统计学意义(P<0.05)。另外,ELISA证明感染可诱导巨噬细胞分泌较高水平的Lf,于感染后6、12、18、24h均高于正常对照组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。由此可知,结核分枝杆菌感染导致巨噬细胞内的TfR和Lf表达更高。     

结核分枝杆菌mpt64基因稳定表达细胞系的建立

为建立稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白MTP64的P815细胞系,将mpt64基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-),构建mpt64真核表达载体.重组质粒酶切鉴定正确后,以Lipofectamine2000转染P815细胞,通过G418筛选后,得到阳性克隆,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达,间接免疫荧光和Western-blot检测目的蛋白的表达.表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的真核表达载体转染细胞后,RT-PCR可扩增出目的基因片段,转染细胞间接免疫荧光检测阳性,Western-blot检测在约26 kDa处有特异显色条带,证实转染细胞表达目的基因.成功地建立mpt64稳定表达细胞系,为进一步结核疫苗评价奠定一定基础.