淀粉酶产色链霉菌TUST2中ε-聚赖氨酸降解酶的纯化和性质

分离得到产抗菌聚氨基酸--ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌TUST2,从中纯化了ε-聚赖氨酸降解酶,并对其性质进行了研究.结果表明,该酶为膜结合蛋白.为提取该降解酶,先收集菌体细胞并用超声波破碎,细胞膜部分用1.0 moL/L NaSCN溶液溶解.将粗酶液进行Sephadex G100凝胶柱层析分离.用100mmol/L磷酸缓冲液洗脱,收集活性部分.纯化后的样品用SDS-PAGE检测,酶亚基分子量约为54700.酶活力在pH=6.0～9.0间稳定,最适宜pH=7.0.酶的最适温度为30℃,在10～50℃水浴30 min酶活力未见明显下降.研究了不同金属离子对酶活力的影响,结果表明,Zn~(2+),Cu~(2+)和Fe_(3+)可分别提高酶活力29.72%,15.85%和15.08%;但Ag~(+),Hg~(2+),Co~(2+)和Mn~(2+)对酶活力有强烈的抑制作用.Ca2~(2+),K~+和Ba~(2+)对酶活力没有影响.添加4%Tween-80能提高酶活力10%,但EDTA能强烈抑制酶活力.研究结果表明,此降解酶的性质与白色链霉菌产生的ε-聚赖氨酸降解酶的性质相似.     

淀粉酶产色链霉菌TUST2中ε-聚赖氨酸降解酶的纯化和性质

分离得到产抗菌聚氨基酸ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌TUST2, 从中纯化了ε-聚赖氨酸降解酶, 并对其性质进行了研究. 结果表明, 该酶为膜结合蛋白. 为提取该降解酶, 先收集菌体细胞并用超声波破碎, 细胞膜部分用1.0 mol/L NaSCN溶液溶解. 将粗酶液进行Sephadex G100凝胶柱层析分离. 用100 mmol/L磷酸缓冲液洗脱, 收集活性部分. 纯化后的样品用SDS-PAGE检测, 酶亚基分子量约为54700. 酶活力在pH=6.0~9.0间稳定, 最适宜pH=7.0. 酶的最适温度为30 ℃, 在10～50 ℃水浴30 min酶活力未见明显下降. 研究了不同金属离子对酶活力的影响, 结果表明, Zn²⁺, Cu²⁺和Fe³⁺可分别提高酶活力29.72%, 15.85%和15.08%; 但Ag⁺, Hg²⁺, Co²⁺和Mn²⁺对酶活力有强烈的抑制作用. Ca²⁺, K⁺和Ba²⁺对酶活力没有影响. 添加4%Tween-80能提高酶活力10%, 但EDTA能强烈抑制酶活力. 研究结果表明, 此降解酶的性质与白色链霉菌产生的ε-聚赖氨酸降解酶的性质相似.     

鸡心辅酶Q-细胞色素c还原酶亲和层析分离及亚基拆分

本文证明鸡心线粒体辅酶Q-细胞色素c还原酶,于低离子强度下经Triton X-100增溶,亲和层析分离,得到单分散相的酶-Triton复合物。每微克分子酶含有低于0.15μmol辅酶Q以及12μmol的磷脂。还原态鸡酶的细胞色素b在α区表现两个吸收高峰,位于558,562nm;细胞色素c_1的α-吸收峰为553nm。SDS凝胶电泳指出,纯化的酶复合物至少由9个亚基组成。在高浓度盐和Triton X-100的作用下,酶复合物被解离为亚基复合物。三只氧化还原亚基(细胞色素b,c_1和Fe-S蛋白)被进一步分离、纯化。     

定向进化提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力

通过定向进化的方法, 提高了一个新的源于枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 的脂肪酶 (BSL2) 的活力. 经过两轮易错 PCR 以及高通量筛选, 最终获得了比活力为野生出发酶 4.5 倍的突变体 3-1B2. 基因比对结果表明, 共有两个氨基酸发生了突变. 突变酶的酶学性质研究发现, 与野生酶相比, 它的热稳定性及 pH 稳定性略有增加, 最适温度和最适 pH 值则无太大的变化. 同源模建了 BSL2 与 3-1B2 的结构, 并与底物进行了分子对接. 结果表明, 突变体 3-1B2 的结合能比野生型 BSL2 低 1.29 kcal/mol, 活性中心 Ser77 残基与底物羰基的距离也由 0.319 nm 减小为 0.278 nm, 因而加快了酶反应速度, 提高了酶活力.     

小麦丛矮病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶

本文证明小麦丛矮病毒含有依赖于RNA的RNA聚合酶,酶活力与病毒的核衣壳(NP)有关。NP的体外转录需要四种三磷酸核苷酸和Mg~2+,一定的盐浓度以及某些还原剂的存在能增大酶活力。通过SDS解聚和超迷离心可以将NP分解为上清和沉淀两个部分,上清含有NP的三种结构蛋白,L,N和NS;沉淀主要为病毒RNA。上清蛋白与病毒RNA的重新组合能再现病毒的RNA聚合酶活力,并且当蛋白与RNA的配比为100:7.7(W/W)时,RNA聚合酶重组活力达到最高。     

酵母羧甲基甘油醛-3-磷酸脱氢酶光照形成NAD荧光衍生物时的协同作用

本文表明与兔肌酶相同,活性部位巯基羧甲基化的酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶在NAD 存在下,经紫外光照,形成一发射峰为410毫微米的荧光衍生物。对于在四个活性部位中只有两个被引入羰甲基的酵母酶,也得到同样的结果。用蛋白内禀荧光淬灭方法测定这两种羧甲基酶,结合NAD~ 均为极微弱的负协同性,或几乎无协同性;但根据荧光衍生物形成的测定,两者却均为正协同性,这可能是由于NAD~ 和酶朊的结合方位在含荧光衍生物的酶中与天然酶中较为接近所致。     

果糖-6-磷酸-2-激酶的色氨酸残基的研究

NBS滴定PFK-2的紫外光谱的结果表明,该酶可滴定Trp残基数为4个其中2个是活性必需的。 用295nm的紫外光激发果糖-6-磷酸-2-激酶(PFK-2),在335nm附近有较强的发射荧光。该荧光能较专一反映PFK-2的Trp基团的状态。底物果糖-6-磷酸对该荧光不影响,ATP引起荧光吸灭。最大吸灭幅度为30％左右。 采用荧光滴定方法测定ATP与酶的结合,得出解离常数(K_i)在低浓度ATP时为0.033mmol/L,高度时为0.23mmol/L。表明该结合具有负协同性。Mg~(2+)、无机磷均降低ATP与酶的K_i值而表现为激活因子;果糖-6-磷酸和果糖-2,6-二磷酸酸对K_i值不影响。ATP结合后引起了该酶构象上的较大的变化。 在ATP保护下,PFK-2对NBS的失活速度稍有增加。丙烯酰胺荧光滴定的结果是,在有无ATP时的Stern-Volmer常数(K_(SV))皆为4.0。     

小鼠肝果糖6-磷酸,2-激酶的纯化及动力学研究

经过超离心,聚乙二醇分级沉淀及DEAE-Sephadex,Blue-Sepbarose。磷酸纤维素三种柱层析等一系列过程,纯化了小白鼠肝脏的果糖6-磷酸,2-激酶。经凝胶过滤和SDS聚丙烯酰胺电泳方法测出该酶是由两个相同亚基构成的分子量为110000的蛋白。Mg~(2+)是其活性所必需的,活化方式呈正协同性。酶与底物的结合方式,对果糖6-磷酸表现正协同性,对ATP无协同性,其Km值随果糖6-磷酸的浓度减小而增大,表明酶的作用为顺序机制。活性中心有一个必需氨基酸残基与结合ATP有关,结合后,其侧链pKa由9.5移至9.8。     

Palinurus versicolor龙虾肌肉D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶与辅酶结合的初步晶体学研究

本文培养了三种Palinurus versicolor龙虾肌肉D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶的晶体:脱辅基酶、脱辅基羧甲基酶和每四体含两个荧光NAD衍生物的酶晶体。用X射线衍射法测定了它们的空间群与晶胞参数。结果表明这些晶体以及对应的为NAD~+所饱和的holo酶晶体彼此同晶,良好的同晶性提示着,此种种属来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶与辅酶的结合不大可能导致如同Bacillus stearothermophillus酶那样涉及结构域相对运动的较大幅度的构象变化。     

矢车菊甙-辣根过氧化物酶-过氧化氢新体系及其在酶联免疫传感分析中的应用

以一种天然色素矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucose,CAG）为辣根过氧化物酶（HRP）底物建立了矢车菊甙-辣根过氧化物酶-过氧化氢新体系.CAG在540nm处有一个吸收峰（AP1）,在HRP催化下被H2O2氧化,AP1降低;同时,其氧化产物在482nm处产生一个新吸收峰（AP2）,并且反应体系中两峰值的比值R（AP2/AP1）与HRP量在一定浓度范围内呈线性相关.根据此原理,以猪口蹄疫病毒蛋白（food and mouth disease virus antigen,FMDVAg）为分析模型,建立了检测猪口蹄疫病毒的酶联免疫传感分析新方法.该方法利用伴刀豆蛋白（Conconvalina,ConA）对糖蛋白的识别特性固定HRP-猪口蹄疫病毒抗体连接物（HRP-FMDVAb）,由ConA介导和磁性分离实现了免疫反应特异性组分和非特异成分,以及反应免疫磁性珠与没反应免疫磁性珠的分离.运用制备的传感体系测定猪口蹄疫病毒的线性范围为1.5×10^-8～2.7×10^-6g/mL,抗原检出限为3.1×10^-9g/mL,相对标准偏差为3.7%（n=11）.底物CAG及其产物的水溶性好,对人体无毒副作用,在临床上可代替传统HRP底物进行免疫检测.     

1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮-4,5-二巯基类复合物在不同波长下的三阶非线性光学性质

合成了两种新的金属双噻吩类复合物:(苄基三乙基铵)双(1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮-4,5-二巯基)-金(BTEAADT)和(苄基三乙基铵)双(1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮-4,5-二巯基)-镍(BTEANDT).采用Z扫描方法,在皮秒脉冲下,分别测试了两种材料的乙腈溶液在532和1064nm的三阶非线性光学特性.Z扫描的结果表明,BTEAADT的乙腈溶液在532nm具有反饱和吸收效应,在1064nm非线性吸收效应可以忽略且在两种波长都有自散焦效应,三阶非线性折射率为负值.BTEANDT的乙腈溶液在532nm非线性吸收效应可以忽略,在1064nm具有饱和吸收效应且在两种波长都有自聚焦效应,三阶非线性折射率为正值.分析了造成这种差异的原因.经过计算得到了两种材料在532和1064nm的三阶非线性折射率,三阶非线性吸收系数,三阶非线性极化率和超极化率.BETAADT的非线性折射率在532nm为-1.685×10-18m2·W-1,在1064nm为-1.459×10-18m2·W-1;BTEANDT的非线性折射率在532nm为1.452×10-18m2·W-1,在1064nm为7.311×10-18m2·W-1.两种材料的三阶非线性吸收系数,三阶非线性极化率和超极化率的数量级分别是10-11m·W-1,10-13esu和10-31esu.结果表明这两种材料在非线性光学领域有潜在的应用价值.     

1,2-双十六烷基-3-甘油-磷酸乙醇胺的合成研究

1,2-双十六烷基-3-甘油-磷酸乙醇胺(DHPE)属于甘油磷脂的一种,在生物学方面具有广泛的应用.报道了化合物DHPE的合成,合成路线以(S)-(+)-甘油醇缩丙酮、十六醇、乙醇胺为起始原料,得到了关键中间体1,2-双十六烷基甘油醇和Boc保护乙醇胺,然后通过Still-Gennari试剂将二者进行偶联,随后利用Horner-Wadsworth-Emmons反应高效的脱去磷脂上的乙酸甲酯基团,最终经过8步反应,以32%的总收率得到目标化合物DHPE.     

新显色剂1-(4-硝基苯基)-3-(5-氯吡啶)三氮烯的合成及其与镉的显色反应

报道了1-(4-硝基苯基)-3-(5-氯吡啶)三氮烯(NPCPDT)的合成及其与镉的显色反应研究。在Triton X-100的存在下,pH 11.5的Na2B4O7-NaOH缓冲溶液中,该试剂能与镉发生显色反应,镉与NPCPDT形成摩尔比为1∶3的黄色配合物,在440 nm处有一最大吸收,在535 nm处有一最大负吸收。以440 nm为参比波长,535 nm为测量波长进行双波长测定,表观摩尔吸光系数为2.68×105L.mol-1.cm-1,镉的质量浓度在0~0.48μg/mL范围内符合比尔定律。用拟定方法测定废水和环境水样中的微量镉。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的磷酰化部位与磷酰化条件

本文报道了从磷酰化的果糖1,6-二磷酸酯酶的胰蛋白酶水解物中分离得到了一个磷酰化的肽段及该肽段的氨基酸排列顺序和磷酰化的部位是在丝氨酸残基上。果糖1,6-二磷酸,果糖6磷酸和腺嘌呤核苷-磷酸等效应剂不影响该酶被无机正磷酸磷酰化。pH对磷酰化程度的影响和对酶活力的影响一致。磷酰化酶的活力比非磷酰化状态的酶活力稍低,活力的差别随着底物浓度的减小而增大。磷酰化的酶与Mg~(2+)和果糖1,6-二磷酸一起保温能脱磷酰化,本文结果进一步支持了蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶在催化果糖1,6-二磷酸水解的过程中,包含了形成磷酰化酶中间物这一过程。     

1-(4-硝基苯)-3-(3-甲基吡啶)-三氮烯的合成及其与锌的显色反应

报道了显色剂1-(4-硝基苯)-3-(3-甲基吡啶)-三氮烯的合成及其与锌的显色反应研究。在Triton X-100存在下,pH 11.0的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中,该试剂能与锌发生显色反应,锌与显色剂形成摩尔比为1∶4的黄色配合物,在445 nm波长处有最大正吸收峰,在535 nm波长处有最大负吸收。以445 nm为参比波长,535 nm为测量波长进行双波长测定,表观摩尔吸光系数为1.88×105L.mol-1.cm-1,锌浓度在0~12μg/25 mL范围内符合比耳定律。用拟定方法测定植物样品中微量锌,分析结果的相对标准偏差均小于2.5%,加标回收率在99.6%~100.4%之间。     

鸡肝果糖-6-磷酸-2-激酶的巯基与碱性氨基酸残基的研究

本文报道半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸等残基在鸡肝果糖-6-磷酸-2-激酶的作用。DTNB修饰的结果表明鸡肝PFK-2每亚基具有9个巯基。其中,在中性pH下可滴定的巯基数目为6个;在Fru6P存在下的可滴定巯基数为4个;而在ATP存在下的可滴定巯基数为7个。在修饰的过程中酶的活力随着被滴定的巯基数目的增加先是提高后为下降,但最后的酶仍不低于初始活力。NEMI对该酶活力的影响与DTNB的相似,它的修饰首先使酶活力升高,当巯基完全被修饰后的活力仍不低于初始活力。但是PCMB和碘代乙酸对该酶的活力影响很小。pH动力学结果显示该酶有1个pK~a为9.0的必需基团,它很可能是赖氨酸残基。PLP和苯乙二醛修饰PFK-2皆可导致该酶的失活。Fru6P对PLP的作用有强烈的保护,Fru2,6P2和Pi也有一定的保护作用,而ATP则稍有增加PLP对该酶的失活作用;苯乙二醛修饰的结果和PLP不同,Fru2,6P2有较强的保护作用,ATP有部分保护作用,Fru6P则对失活完全无保护作用。以上结果表明赖氨酸残基是鸡肝PFK-2与底物Fru2,6P2结合有关的必需残基,而精氨酸可能是该酶与产物Fru2,6P2结合有关的残基。     

产甘油基因工程菌的构建

利用途径工程的基本原理,在大肠杆菌中构建一条产甘油的新代谢途径。从酿酒酵母Sacchdromyces cerevisiae INVSc1菌株总DNA克隆3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpdl)和3-磷酸甘油酯酶基因(hot2),构建由两个杂合启动子trc启动基因的双表达盒的重组质粒pGEM-Cgpd1-Chor2,后者转入E．coli JM109菌株,构建的重组菌株就具有一条直接将葡萄糖转化为甘油的新代谢途径,将该重组菌株以葡萄糖为底物进行摇瓶发酵,甘油产率为1．18g／L。该研究结果为进一步构建生产1,3-丙二醇工程菌打下了基础。     

酶解小麦蛋白产物-还原糖美拉德反应的光谱研究

采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究了酶解小麦蛋白产物与还原糖不同加热条件下的美拉德反应及其产物.美拉德反应在紫外区240和294 nm产生两个特征峰,荧光的最大激发和发射波长为347和450 nm;随反应进行,紫外光吸收和荧光强度迅速增加,表明美拉德反应进入高级阶段,产生的糠醛类、呋喃酮类、吡喃酮类、噻吩类及噻唑类等小分子物质表现较大的积累速率.温度升高,强度增加速率增大.在较高温度时,紫外光吸收出现最大平稳值;荧光强度则到达最大值后降低,表明小分子物质间或与肽聚合生成大分子黑素类物质,小分子物质的积累表现消除速率,反应进入终级阶段.     

1-(2-苯并噻唑)-3-(4-硝基苯)－三氮烯的合成 及其与镉(Ⅱ)的显色反应研究

报道了1-(2-苯并噻唑)-3-(4-硝基苯)－三氮烯(BTNPT)的合成及与镉(Ⅱ)的显色反应研究。在Triton X-100的存在下,pH 11.6时,镉(Ⅱ)与BTNPT形成摩尔比=1∶2型黄色络合物,在435 nm处有一最大正吸收,在530nm处有最大负吸收。以435 nm为参比波长,530nm为测量波长进行双波长测定,表观摩尔吸光系数为 2.52×10     

同位素标记及未标记的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸的合成方法

萜类化合物构成了最大的一个天然产物家族,结构复杂多变,且有许多重要的生理活性.2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径是近年来发现并建立的一条萜类化合物的生物合成途径,其中所涉及到的酶均可作为靶标来进行新抗菌素的筛选.综述了以化学合成及酶催化合成方法制备MEP途径中关键中间体1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸和2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸的进展,并着重介绍了同位素标记的这两个化合物的制备方法.