拟南芥AtGLR1.3和AtGLR3.3启动子的GUS基因融合表达

用启动子融合GUS基因的方法,研究了AtGLR1.3和AtGLR3.3基因在拟南芥植株的组织表达.结果表明：这2个基因分别在植株的不同组织和器官内表达,具有组织表达的特异性,其中AtGLR1.3主要在根部的皮层和托叶着生部位表达;AtGLR3.3主要在植株的维管组织中表达,尤其在根部、胚轴和叶的维管组织中.从这2个基因分别在皮层和维管组织中表达,推测它们的功能与Ca2＋吸收和转运相关.     

GUS基因在大麦叶肉原生质体中瞬间表达的研究

本研究以GUS(刀一葡塘翻酸酶)基因为报道基因，采用PEG转化法，对大麦(Hor-deu m vulgare)叶肉原生质体进行直接转化.转化处理后的原生质体在MSPI 12M培养基中培养i-r天后，用底物a-Gluc的组织化学定位法和底物MUG的荧光分析法分别检测到GUS基因在大麦叶肉原生质体中的瞬间表达.兰细胞计数的统计结果表明，在转化处理后42-72小时转化细胞中GUS酶活力最高，最高转化率达5.400.实验结果还表明，不同的PEG浓度影响转化效率，7.50o PEG(终浓度)处理转化效果最佳.     

农杆菌介导转化新疆棉花体系的优化

以新疆主栽棉花品种新陆早19号和新陆早23号下胚轴为外植体,以GUS基因为报告基因,通过检测GUS基因在转化后的棉花下胚轴中瞬时表达情况,分析了菌液浓度、浸染时间、乙酰丁香酮浓度、超声波辅助处理、共培养温度和共培养时间等因素对GUS瞬时表达的影响.实验结果表明:菌液浓度OD600=0.5,浸染时间15 min,乙酰丁香酮浓度100μmol/L,24 C共培养72 h的转化条件下GUS基因瞬时表达率最高.     

植物乳杆菌谷氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达

构建植物乳杆菌谷氨酸脱氢酶基因原核表达载体,表达并纯化蛋白。本研究以植物乳杆菌ZDY 2013基因组DNA为模板,PCR扩增谷氨酸脱氢酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达和镍柱亲和层析后获得目的蛋白,活性测定显示该蛋白具有谷氨酸脱氢酶的活性。同时,对表达菌株的酸耐受性测定结果表明,细胞对pH 4.5的酸胁迫耐受性提高1.4倍。实验结果为深入研究植物乳杆菌ZDY 2013谷氨酸脱氢酶保护细胞抵御酸胁迫提供有益的参考。 更多还原     

用于选择性优产雄烯二酮的工业小金色分枝杆菌的基因改造

工业上用于生产4-雄烯-4-醇-3,17-二酮(4-雄烯二酮,4-AD)的小金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)在降解植物甾醇侧链的过程中同时产生部分1,4-雄烯-4-醇-3,17-二酮(1,4-雄烯二酮,ADD),而3-甾酮-Δ1-脱氢酶KstD催化了4-AD到ADD的转化.克隆该工业菌株的kstD基因测序后发现,其与报道的标准分枝杆菌基因组中的kstD基因相比有3个氨基酸的突变(A6E,S138L,A193V).这些突变使得KstD的酶活受到影响,一定程度上阻碍4-AD向ADD的转变.为了实现从植物甾醇降解中选择性地得到4-AD或ADD,通过敲除kstD基因,阻断4-AD到ADD的转化,获得一株只产4-AD的突变菌株,代谢产物中4-AD达79.3%.通过修复kstD酶的氨基酸位点,使之恢复到文献报道的正常序列,并在敲除kstD基因菌株中,将修复后的kstD基因安置在强启动子pG13下,重新导回到突变菌株中进行回补强化表达,获得一株可以大量产生ADD的菌株.野生型分枝杆菌转化植物甾醇产生的产物中,ADD仅占27.0%,经回补强化表达后的基因工程菌株转化植物甾醇产生的产物中ADD占63.0%.结果表明,通过敲除或者在突变体菌株中过表达正常的kstD基因可以使该工业菌株选择性地优产4-AD或ADD.     

果蝇heix基因启动子的分析及其转录活性鉴定

采用生物信息学的方法,综合运用启动子预测工具Promotor Scan1.7和BDGP(neural network pro-moter prediction)分析了目标序列的启动子特征,以果蝇基因组DNA为模板扩增出heix基因启动子候选序列连接至pMD19T载体,构建了荧光素酶报道基因重组质粒pHeixpromoter-Luc,转染果蝇S2细胞表达荧光素酶,并测定了荧光素酶的活性.预测出4个候选的heix基因启动子序列,发现存在ATF、MLTF、c-fos_US5等多种转录因子调控基序;成功构建了pMD19T-Heixpromoter和pHeixpromoter-Luc重组质粒.与肌动蛋白启动子(actinp romoter)相比,pHeixpromoter-Luc表达出的荧光素酶也有较强的活性.本研究找到了果蝇heix基因启动子候选序列,并发现多种转录调控元件,其荧光素酶报告基因实验说明果蝇heix基因启动子与肌动蛋白启动子有相当的转录活性.     

盐生盐杆菌启动子DNA片段的特征序列及其功能分析

利用启动了探针质粒pKK232－8从古菌盐生盐杆菌中分离到许多具有细菌基因启动子功能的DNA片段,对其中3个片段RM07、RM08和RM13的序列测定,发现这3个片段上均具有典型的细菌基因启动子的保守序列（－35和－10区）,其中的2个片段RM07和RM13还分别具有古菌或真核生物启动子的典型特征序列,利用大肠杆菌－酵母菌启动子探针梭载体pYLZ－2将3个片段分别导入大肠杆菌和酵母菌中,通过检测（－半乳糖苷酶活性,进一步从功能上获得了确证,这是首次从结构和功能上发现并证实了来自古菌的DNA片段上具有二界或三界生物的特征,从而为进一步揭示古菌之谜和丰富生物的 进化关系提供了新的信息和途径,并有可能为构建双功能表达载体提供新的启动子来源。此外,在所获得的3个片段上还发现了类似于细菌σ^54启动子的典型,这是否暗示古菌为了适应极端环境所进行的转录调控有关,还有待进一步的研究。     

集胞藻PCC6803脂肪酸脱饱和酶基因desD在转基因水稻中的表达

为了提高水稻的耐冷性，从集胞藻PCC6803中克隆酰基脂肪酸脱饱和酶基因desD与植物表达载体pCAMBIA1301连接，构建了重组质粒pCdesD。采用农杆菌介导的水稻愈伤组织转化系统将desD基因成功地导入粳稻中花11号和朝鲜的平壤21号中，获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析，证明外源基因已导入并整合到水稻的基因组中；分子检测外源基因单拷贝整合的转化体在T1代呈现3：1的分离。Northern杂交结果表明该基因在mRNA水平上获得表达。低温胁迫处理后，对转基因水稻进行脂肪酸成分和光合生理分析，结果表明转基因水稻提高了不饱和脂肪酸含量，光合生理也得到了改善，水稻的耐寒能力明显增强。     

嗜麦芽菌素P28尾鞘基因启动子活性分析

嗜麦芽菌素P28是由嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)合成的细菌素,启动子Ps控制其主要结构基因(尾鞘基因和尾管基因)的转录.本研究首先用RACE方法确定嗜麦芽菌素P28的主要结构基因转录起始位点位于尾鞘基因翻译起始位点ATG上游47bp处的G碱基,然后以lacZ(β-半乳糖苷酶基因)为报告基因对201bp长的启动子Ps从5′端进行缺失突变,发现具有启动活性的最小启动子片段长度为55bp.当启动子片段截短为89bp时,启动子Ps-89活性不仅有明显升高,同时不受丝裂霉素C影响.扫描突变分析Ps-201启动子中124bp与89bp之间的碱基,结果显示,碱基序列-GTCTG-是Ps-201的关键调控序列,突变后活性提高了2.53倍.     

一种水稻愈伤组织特异性启动子的克隆及其应用

筛选标记基因是一种用于植物遗传转化后阳性转化子筛选的有效手段,但目前介导标记基因表达均采用组成性启动子.这些启动子虽然在植物遗传转化得到了广泛应用,但由于是组成性表达,在转基因的生物安全性存在标记基因的安全性担忧.为了克服这一缺点,本文从水稻基因组内克隆了水稻半胱氨酸蛋白酶基因(Cyctein protease,CP)的启动子,通过gus转基因的验证,该启动子只在愈伤组织表达,不在水稻根、茎、叶等组织表达,为愈伤组织特异性表达启动子(Callus-specific Promoter,CSP).将该启动子用于介导筛选性标记基因的表达,通过对筛选性标记基因潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的密码子优化,明显提高了CP启动子在水稻转基因选择的转化效率,质粒转化效率和阳性植株率均达到了pCAMBIA1301的35S启动子介导标记基因hpt的选择效果.     

乳腺癌肿瘤抑制候选基因5基因启动子甲基化水平研究

探讨人正常乳腺细胞株及不同乳腺癌细胞株肿瘤抑制候选基因5启动子甲基化状态,并分析其与雌激素受体、孕激素受体、人类表皮生长因子受体2的表达相关性。运用焦磷酸测序分析4种乳腺癌细胞株和1种人类正常乳腺细胞株中TUSC5基因启动子甲基化状态,以及实时荧光定量逆转录聚合酶反应和Western印迹来检测这些细胞株中TUSC5基因mRNA和蛋白的表达。结果表明：正常人类乳腺细胞株存在TUSC5基因启动子低甲基化,而4种乳腺癌细胞株存在不同程度高甲基化;在4种乳腺癌细胞株中,激素受体及 HER-2表达阴性即三阴性乳腺癌细胞TUSC5基因启动子甲基化水平较非三阴性乳腺癌细胞低;并且乳腺癌的发生可能与TUSC5基因启动子高甲基化有关,乳腺癌TUSC5基因启动子甲基化水平与激素受体、HER-2表达具有一定相关性,其发生的机制需进一步研究探讨。     

表达猪瘟病毒E2基因和gfp报道基因的伪狂犬病病毒双基因转移载体的构建

将以PRVgG为启动子，SV40plyA为加尾信号的CSFV E2表达盒克隆于包含伪狂犬病病毒（PRV）tk基因和gH基因片段的重组质粒pTK2.5,替换掉tk基因的SalⅠ与XhoⅠ酶切位点之间的序列，构建了携带CSF E2基因的转移载体pTKE2。免疫荧光检测证实，转染BHK21细胞pTKE2在感染PRV的情况下，能表达E2蛋白，采用特异性引物PCR方法扩增gfp表达盒，对酶切位点进行改造，将其克隆到pTKE2的SalⅠ位点，构建了利用PRV gG启动子和HCMV IE启动子分别控制E2基因和gfp基因表达，两基因取向相反的双基因转移载体pTKE2.EFP.将双基因转移载体pTKE2.GFP转染BHK21细胞中，12h后在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的GFP表达，表达的GFP不引起细胞毒性。     

草原兔尾鼠ZP3基因密码子优化及其在酵母中的表达

目的:提高草原兔尾鼠(L agurus lagurus)卵透明带3(LZP 3)基因在酵母细胞中表达的水平.方法:利用重叠PCR技术,定点突变LZP 3基因上6个稀有的密码子簇,将LZP 3基因中11个稀有的密码子更换成毕赤酵母(P ich ia Pastoris)最常用的相应密码子.将获得的LZP 3突变基因(LZP 3m)插入pGAPZαA中,构建穿梭表达载体.以重组体转化P ich ia Pastoris SM D 1168菌株进行表达.结果:LZP 3m基因的表达量比野生型LZP 3基因明显提高.结论:通过密码子优化,能显著提高LZP 3基因在酵母细胞中的表达水平.     

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒pΔGP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失突变gag和pol基因,并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR,构建辅助质粒pΔGP.将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP和辅助质粒pΔGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系,荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI EGFP和pΔGP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白,转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白,而转染有辅助载体pΔGP的HIC细胞不表达绿色荧光.结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功,表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性,并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子.     

RM07 DNA片段在嗜盐古生菌中的启动子功能研究

以二氢叶酸还原酶基因(dhfr)和β-半乳糖苷酶基因(bgaH)为报告基因，利用启动子探针检测技术研究了在大肠杆菌和酵母菌中均具有启动子活性的RM07DNA片段在嗜盐古生菌中的功能，结果从mRNA转录和蛋白质表达水平证明RM07片段在嗜盐古生菌中同样具有启动子功能．缺失分析进一步定位了RM07片段中启动子活性必需的重要功能区，启动子缺失突变分析的结果与序列结构特征分析的结果相吻合．     

类人胰岛素原多拷贝重复基因原核表达载体的构建与表达

根据大肠杆菌密码子偏好性,优化人胰岛素原基因序列,同时用2个赖氨酸取代C链。重叠PCR扩增法克隆优化的类人胰岛素原基因,PCR扩增引物中引入胰蛋白酶酶切位点和核酸限制性内切酶识别位点。经酶切、拼接获得类人胰岛素原多拷贝基因,并构建人胰岛素原基因多拷贝原核表达载体,转化感受态大肠杆菌诱导表达融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳,考马斯亮兰染色和融合蛋白染色条带光密度分析表明,含有4拷贝的类人胰岛素原重复基因序列原核表达载体的诱导表达类人胰岛素原效率最高,是单拷贝类人胰岛素基因原核表达载体表达效率的3倍左右。表达产物经质谱鉴定,确定为优化设计的类人胰岛素原,表明构建的多拷贝类人胰岛素原基因表达载体可应用于后续人胰岛素原的高效表达生产研究。     

人乙醇脱氢酶ADH1B2在毕赤酵母中的表达及活性分析

根据GeneBank中人乙醇脱氢酶ADH1B2基因序列设计引物,以人肝脏总RNA为模板,反转录获得人乙醇脱氢酶基因.将克隆基因与表达载体pPICZB连接,测序正确的pPICZB-ADH1B2电转化毕赤酵母GS115;重组毕赤酵母工程菌经0.5%（v/v）甲醇诱导72 h后目的蛋白以可溶形式表达,经DEAE-Sepharose FF纯化后蛋白酶活性可达8 000 U·mg^-1.同时构建重组质粒pCDNA3.1-ADH1B2转染HepG2人肝癌细胞,发现细胞内ROS/GSH水平降低,Akt磷酸化水平降低,细胞活性下降.为临床酒精中毒预防和治疗药物的研发以及ADH在肝脏肿瘤方面的研究提供了理论基础.     

牛磺酸通过MST1-Akt通路诱导人结直肠癌细胞自噬的初步研究

探讨牛磺酸(Tau)对结直肠癌细胞自噬的影响及初步机制。用牛磺酸处理结直肠癌HT-29和SW480细胞,荧光显微镜(MDC染色)检测细胞自噬体形成,Western blotting分析细胞中自噬及MST1-Akt通路相关蛋白表达。MDC染色显示,40 mmoL处理组和80 mmoL处理组荧光标记自噬颗粒较Control组明显增多,并出现大量自噬体和自噬溶酶体,即40～80 mmoL Tau能诱导自噬小体形成;Western Blotting结果显示,随着Tau浓度增加,HT-29和SW480细胞中MST1,Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达也呈显著性增加(P0.01),而HT-29细胞Akt蛋白表达及p-Akt(Ser473)水平则呈显著性降低(P0.01);且MST1蛋白过表达能增加HT-29细胞Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白表达,降低Akt蛋白表达;Tau可能通过MST1-Akt通路增强结直肠癌细胞中Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达,诱导自噬。     

蝎神经毒素AaIT的表达及功能分析

在不改变氨基酸编码序列的情况下，根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计并人工合成了适合于大肠杆菌表达的蝎神经毒素AaIT基因．将该基因插入到大肠杆菌表达载体PET32a＋中，得到重组质粒PET32a-AaIT，将该质粒转入带有trxB／gor双突变的大肠杆菌Origami（DE3），重组菌株经IPTG诱导后，获得町溶性表达产物，但该表达产物没有生物学活性．把此基因插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC6αA构建重组质粒pPIC6αA-AalT，转化毕赤酵母（X-33），经甲醇诱导后，获得高水平的分泌表达（20mg／L）．表达产物喂食银纹夜蛾及甜菜夜蛾没有表现出生物活性，经注射有活性．     

棉铃虫乙醇脱氢酶5的原核表达和活性分析及其抗血清的制备

本课题组前期基于酵母单杂交技术筛选出响应2-十三烷酮诱导CYP6B6过表达的6个调控因子,乙醇脱氢酶5(HaADH5)是其中之一,乙醇脱氢酶是一种代谢乙醇的重要酶类,在哺乳动物中的研究很多,但在昆虫中的研究很少.为了进一步探究HaADH5是否参与P450 CYP6B6的过表达,进而参与棉铃虫对包括杀虫剂在内的外界有毒物...