胰泌素基因的化学合成和克隆

本文报道的内容为胰泌素基因的化学合成和克隆。胰泌素为一由2了个氨基酸组成的肠胃道多肽激素,该多肽合成基因的顺序由计算机辅助设计,共216个核苷酸碱基;合成基因选用酵母细胞偏爱的密码子,并在其中设置了一些便于今后用于基因改造、表达调控和产物分离所需的位点,排除了可能影响酶促连接反应的各种重复顺序;用化学法(固相磷酸三酯法和固相亚磷酸三酯法)合成了12个基因片段,长度为12寡聚核苷酸至24寡聚核苷酸,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化合成产物;利用T_4DNA连接酶组建完整的胰泌素基因,克隆于pWR 13质粒中,构建了一个含胰泌素基因的新质粒pWS 1。     

MDMV外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

报道了玉米矮花叶病毒(MDMV)全长外壳蛋白cDNA基因的克隆、序列分析和表达产物鉴定的结果。根据其cDNA序列推测的外壳蛋白氨基酸顺序全长共有313个氨基酸,分子量总和为35 400 D,与聚丙烯酰胺凝胶电泳估算的值36 000 D相近,克隆的病毒外壳蛋白基因cDNA 3′-末端非编码区含有256个碱基。将此外壳蛋白的基因插入pUC19的1acZ基因中,转入E.coli后诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异性的蛋白带,经Western吸印与抗MDMV的兔血清呈阳性反应,证实所克隆的cDNA基因为MDMV外壳蛋白基因,并且能够正确表达。     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

亮氨酸脑啡肽构象的分子动力学方法研究

采用淬火和模拟退火两种分子动力学的方法对亮氨酸脑啡肽进行了构象搜索，发现了多个Gly－Pheβ－Ⅱ’转角的低能构象．计算结果表明，高温淬火和模拟退火两者结合起来可以有效地寻找低能构象．     

人野生型MBL基因在大肠杆菌中的表达

为获得人MBL蛋白，并对其功能进行初步研究，用DNA重组法构建了组氨到标签融合原核表达质粒pET28(b)-MBL。将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG在37℃条件下诱导培养，利用SDS－PAGE，Westem-blot检测目的蛋白的表达，用IMAC金属螯合层析柱对其进行纯化。成功地表达了重组MBL蛋白，纯化的MBL浓度约为844μg/mL，为制备MBL的基因工程抗体奠定了基础。     

一个HBsAg基因在大肠杆菌中的强表达系统

利用筛选启动基因的载体系统,从大肠杆菌染色体DNA中获得一个启动基因片段。在它的控制下HBsAg基因在大肠杆菌中有较强的表达。通过抗-HBs亲和层析柱分离纯化了表达产物。用琼脂糖双扩散免疫分析法和聚丙烯酰胺——SDS凝胶电泳对分离纯化的表达产物进行了鉴定。     

adr亚型乙型肝炎病毒表面抗原基因在大肠杆菌中的表达

利用adr亚型乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆株,组建表面抗原(HBsAg)基因表达质粒。用竞争性抑制放射免疫分析方法和聚丙烯酰胺——SDS凝胶电泳检测表达产物,获得了含HBsAg的杂合多肽。     

中国人ω1型干扰素基因的克隆、一级结构测定以及在大肠杆菌中的表达

采用聚合酶链反应(PCR)方法,从中国正常胎儿肝细胞染色体DNA中分离并克隆了人ω1型干扰素基因,测定了核苷酸全序列,表明原有争议的第88位密码子为GGA的核苷酸序列是正确的,因此该氨基酸为Gly。随后又利用PCR技术将所获的ω1型干扰素基因原始克隆改造成适于在大肠杆菌中表达非融合蛋白的结构形式,并以pBV220为载体在P_RP_L串联启动子控制下进行温控表达。表达产物的抗病毒活性达6.5×10~7单位/升菌液(O. D_600=0.75)。IFN-ω1不仅具有很高的抗病毒活性,同时在结构上与动物滋养层蛋白高度相似,而后者又是作为母体妊娠识别信号存在于多种动物体内的抗黄体退化蛋白,因此本文获得的这—ω1型干扰素基因及重组蛋白在理论和实际上都有进一步研究的价值。     

中国人HCV基因组NS3区c33-c抗原基因cDNA克隆和在大肠杆菌中表达

本文通过逆转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR)从一份来自山东省泰安市的丙型肝炎病毒(HCV)RNA打点杂交阳性的中国人血清中扩增并克隆到一段约850bp的HCV基因组NS3区c33-c抗原基因,测定该基因的全序列后发现,中国人HCV泰安分离株与HCV Ⅰ型株HCV-US和Ⅱ型株HCV-BK在该基因区段的核苷酸/氨基酸序列同源性分别为79.2％/91.3％和91.3％/93.9％。利用原核高效表达载体pBV220在大肠杆菌中有效地表达了非融合的c33-c重组蛋白,通过免疫筛选法及Western印迹法对约占菌体可溶性蛋白14％的表达产物进行了鉴定。采用Triton X-100和尿素处理表达产物后再进行离子交换层析,纯化得到可用于检测HCV血清抗体的c33-c抗原。利用该抗原与HCV核壳蛋白区的分支状合成肽一起组装成中国第二代免疫酶法(E1A)测定HCV抗体试剂盒,其检测特异性、灵敏度和精密性完全符合HCV诊断试剂的国家质控标准,已基本达到国际上第二代HCV E1A主流试剂的水平。     

霍乱弧菌无毒肠毒素A~-B~+基因在大肠杆菌的表达

应用DNA体外重组技术,成功地将霍乱弧菌毒素(CT)基因,在大肠杆菌中改建成CTA~-B~+基因克隆。组构的pMM-CTB重组质粒,在大肠杆菌中能高表达CTB亚单位,并能分泌到细胞外。     

遗传工程研究获得重大突破——化学合成基因使大肠杆菌生产脑激素

去年十一月二日,美国Riggs和Boyer等七人研究小组报告用化学方法合成的生长激素释放制抑因子(Somatostatin,以下缩写为som)的基因,已通过遗传工程技术重组,转移到大肠杆菌中,并且从这细菌的发酵液成功地获得了期望的脑激素——som,第一次用合成的基因创造了能生产脑激素的大肠杆菌。美国科学院院长Handler欢呼这是“科学上头等的大胜利”。在此以前,虽已有大量基因转移到大肠杆菌中,但是却没有一个能生产预先设计的蛋白质或多肽,例如去年夏天加州大学重组DNA的胰岛素小组报导:大鼠胰岛素基因转移进大肠杆菌已获得成功,但用此细菌生产胰岛素却没有成功。     

亮-脑啡肽基因的合成

本文报道亮-脑啡肤基因的另一个合成途径。合成的基因,26个碱基对,是按照亮-脑啡肽的氨基酸顺序设计的。为了能够插入pBR 322质粒,基因带有EcoRI和BamHI限制性内切酶的单链粘性末端。化学合成的4个片段,8、9、17及18核苷酸,采用改良的三酯法。这些片段都具有正确的结构,最后在T_4-DNA连接酶的作用下,一步装配成脑啡肽基因。产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,具有正确的连接点。     

化学合成基因的新成就

生长激素释放抑制激素(Somatostatin)是哺乳类动物中才存在的,由下丘脑分泌的多肽类激素,是十四肽。根据遗传密码理论,从上述十四肽的化学结构可以推断出该激素的基因(即脱氧核糖核酸DNA)的化学结构。Itakura等人根据这样推测出来的结构,用化学方法合成了相应的DNA,然后将此DNA连结到控制半乳糖苷酶的生物合成的DNA上。这样得到的DNA再连接到大肠杆菌的质粒上。质粒是一种双链环状     

小麦ACCase CT功能域基因在大肠杆菌中的表达及与除草剂的相互作用

以中国春小麦幼苗为材料,克隆构建了小麦质体乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的羧基转移酶(CT)重组质粒( RCP18-5),并实现了重组质粒在大肠杆菌中的可溶性高表达.对重组蛋白的性质研究表明,该蛋白具有较强的疏水性,稳定性不高.为改善这种状况,对CT功能域基因进行了截短和延长,同样于大肠杆菌中进行表达.结果表明,仅长...     

亮氨酸-脑啡肽结合H~+和Li~+的氢氘交换实验与理论研究

气相氢氘交换质谱(HDX-MS)实验与量子化学计算结合,比较了亮氨酸-脑啡肽(YGGFL)结合H~+和Li~+的反应和结构差异性。HDX-MS结果表明,在相同的实验条件下,[YGGFL+Li]~+在交换5个氢原子后,氢氘同位素反应趋于停止,而[YGGFL+H]~+上的9个可交换氢原子均可发生交换。这表明Li~+会降低脑啡肽的氢氘交换率。理论计算发现,两种离子具有不同的最稳定结构:Li~+与脑啡肽肽上的4个羰基氧原子结合能量最低,而脑啡肽氨基端发生质子化后产生最稳定的[YGGFL+H]~+。基于此稳定结构,实验进一步从离子结构差异性和质子亲和势等方面对HDX实验结果进行了分析。     

tPA Kringle-2结构域基因的合成及其在大肠杆菌中表达

本文用固相磷酸三酯法合成了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)174-262片段(Kringle-2结构域)对应的DNA序列。利用PIN Ⅲ OmpA2表达质粒的信号序列和Plpp-lac启动子在大肠杆菌中表达了tPA Kringle-2。约2/3的表达产物分泌在大肠杆菌的周间质中。经硫酸铵盐析,Lysine-Sepharose亲和层析和FPLC-MONOQ离子交换层析等3步纯化后其氨基酸组成和tPA 174-262片段的组成一致。放射结合分析证明重组表达的tPA Kringle-2具有纤维蛋白结合活性。     

酯酶在化学合成中的应用进展

酯酶对于水解、酯化和转酯化等反应具有高活性和立体选择性,其生产成本低于脂肪酶,因而酯酶用作化学合成的催化剂,将使生物催化合成成本更低。分析了酯酶在分子合成中的催化性质,对酯酶催化手性分子和聚合物的合成及其固定化进行了总结和评述,并对其催化作用在化学合成方面的应用发展进行了展望。     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达和分泌

将黑曲霉葡萄糖淀粉酶GAI的cDNA插入到质粒pMA91的酵母PGK基因的启动子和终止序列之间,构成含葡萄糖淀粉酶基因的表达载体pMAG69。用原生质体转化法引入酿酒酵母GRF18,实现黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达,利用基因本身的信号序列使99％以上的酶蛋白分泌至胞外,构建的酵母菌株在含10％淀粉的培养基中2天内能水解87％的淀粉,对酵母转化子的稳定性检测显示,重组质粒pMAG69可在酿酒酵母中较稳定地存在。     

新型小肽疫苗的设计——Ⅰ.多联体生长激素释放抑制因子基因的化学合成、克隆与表达

小分子多肽制备抗体效率很低。我们设计了一种新的制备小肽疫苗的方法——小肽自连疫苗。这种新疫苗无需用其它蛋白质作载体,因此纯度高,单一性强,无其它杂抗原。尤其在需要进行自身免疫时这种疫苗效率较高。根据这种设计,我们合成并克隆了一个多联的生长激素释放抑制因子的基因,经过筛选、鉴定,得到了一个最大为六联体的生长激素释放抑制因子基因。该基因放到大肠杆菌中表达,并做Western检测,得到六联体生长激素释放抑制因子的表达菌株,该菌株的表达产物能与生长激素释放抑制因子的抗体发生免疫反应。