抗拟除虫菊酯类农药广谱性单克隆抗体的研制及鉴定

制备了抗拟除虫菊酯类农药(Pyrethroids)的广谱性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性;以间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,用活性酯法将其与牛血清蛋白(BSA)偶联制得人工抗原PBA-BSA免疫Balb/c小鼠,5次免疫后选择效价最高、对PBA识别能力最强的小鼠取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG1500作用下融合,经间接ELISA筛选及有限稀释法进行亚克隆,分离阳性细胞株,腹水诱导法大量制备单克隆抗体,并用Protein G亲和柱纯化,间接ELISA法测定抗体效价、亚型、亲和力常数及对拟除虫菊酯类农药的作用;UV结果显示,PBA-BSA成功偶联,获得1株稳定分泌抗拟除虫菊酯类农药单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11,其培养腹水抗体效价为1∶6.5×106,其抗体亚类为IgG1,对PBA的亲和力常数为2.5×10 L/mol,对PBA的IC50为208.9μg/L,检出限为21μg/L,对高效氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯和氯氰菊酯的IC50分别为1.01,2.15,3.16和3.67μg/L。     

以烟草花叶病毒为半抗原载体的活体免疫反应

以烟草花叶病毒的赖氨酸突变体(TMV-EPMK)为半抗原载体,利用“点击化学”反应,将半抗原小分子雌三醇(E3)经由两个不同亲/疏水性的连接臂修饰在TMV-EPMK上,成功制备了TMV-EPMK/E3完全抗原。 通过免疫实验发现,以亲水性连接臂制备的TMV-EPMK/E3偶联体可在小鼠体内诱导更高水平的E3特异性免疫反应,所产生的IgG抗体的滴度达21800。 该结果表明,以烟草花叶病毒为载体制备的完全抗原,其免疫原性受连接臂性质的影响,亲水性的连接臂更有利于抗体反应的发生。     

抗羟甲芬太尼单克隆抗体和抗羟甲芬太尼独特型抗体的特性研究

本文采用羟甲芬太尼免疫的BALB/c小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合,获得分泌抗羟甲芬太尼抗体的单克隆杂交瘤细胞株。该株细胞分泌的抗羟甲芬太尼单克隆抗体与羟甲芬太尼结合的亲合力为3.65±0.59×10~7 l/mol。羟甲芬太尼类似物3-甲基芬太尼、β-羟基芬太尼和芬太尼与抗羟甲芬太尼单克隆抗体有部分交叉反应,而DAGO,纳洛酮和双氢依托啡与抗羟甲芬太尼单克隆抗体无交叉反应。应用纯化的抗羟甲芬太尼单克隆抗体免疫家免,获得高滴度的兔抗羟甲芬太尼独特型抗体。抗羟甲芬太尼独特型抗体与抗羟甲芬太尼单克隆抗体结合反应有剂量关系,并呈可饱和性。抗羟甲芬太尼独特型抗体能竞争抑制抗羟甲芬太尼单克隆抗体与原始抗原羟甲芬太尼的结合反应。受体结合分析表明抗羟甲芬太尼独特型抗体能与放射性配体[~3H]羟甲芬太尼和[~3H]DAGO竞争结合大鼠脑匀浆膜蛋白上的阿片受体。在离体生物检定实验中抗羟甲芬太尼独特型抗体还具有类似羟甲芬太尼样作用,能呈剂量依赖地抑制电场刺激引起的小鼠输精管的收缩。以上结果提示抗羟甲芬太尼独特型抗体能与羟甲芬太尼竞争结合抗羟甲芬太尼单克隆抗体上的同一结合位点,具有羟甲芬太尼的内影像结构,并能与μ阿片受体结合,呈阿片受体激动剂样作用。     

抗人IgG重链单克隆抗体和抗人IgG亚类限制性单克隆抗体的鉴定

本文对前获得的4株针对人IgG重链杂交瘤细胞株(1B3,2D5,2A4和2B6)所分泌的单克隆抗体(McAbs)用琼脂糖免疫双扩散试验进行初步分析,发现该4种McAbs是针对人IgG上的三个不同抗原决定簇.利用ELISA竞争试验得到进一步证实.用人IgG亚类免疫球蛋白分析4种McAbs,证明1B3 McAb可与IgG的所有4个亚类反应.其他3种 McAbs为 IgG亚类限制性 McAbs,2B6和 2D5不与 IgG4反应,称缺-IgG4 McAb; 2A4不与 IgG3反应,称缺-IgG3 McAb. 在琼脂糖免疫双扩散试验证实:(1)单独一种McAb 与抗原反应仅能出现透明沉淀线,但在琼脂糖中加入2% PEG 6000可出现常规所见的乳白色沉淀线;(2)将两个McAbs加入同一抗体孔内与抗原反应,当两个McAbs不同时(如2A4与2D5)则出现乳白色沉淀线.上述结果提示可用乳白色沉淀线的出现与否来初步鉴别两种McAbs的异同. 以上亚类限制性McAbs,在未获得亚类特异性McAb以前,可用于制备和纯化人 IgG3和 IgG4,亦可用于研究人 IgG的抗原分析。     

稻瘟灵单克隆抗体的制备及评价

该文制备了农药稻瘟灵的单克隆抗体,并建立了稻瘟灵的酶联免疫吸附（ELISA）检测方法。在完全保留稻瘟灵结构的基础上从二硫杂环戊烷结构中衍生不同长度的活性手臂制备了2个半抗原,并分别与载体蛋白偶联合成免疫原与包被原。通过小鼠免疫、细胞融合、淘筛、腹水制备等步骤获得特异性识别稻瘟灵的单克隆抗体mAb-DWL。结果显示,基于mAb-DWL构建的间接竞争ELISA法的半抑制浓度（IC50）为55.2 ng/mL,线性范围为4.6～530.2 ng/mL,其与结构类似物的交叉反应可忽略不计。所建立的ELISA方法对蔬菜及粮食等样品的加标回收率为77.2%～116%,可用于实际样品的快速检测。     

稀土离子诱导钙调蛋白构象变化后的单克隆抗体制备

采用单克隆抗体技术研究了三价稀土离子与钙调蛋白作用后对其与靶分子识别能力的影响。牛脑钙调蛋白经2.4-二硝基氟苯修饰后再结合三价的铕离子,然后免疫Balb/c小鼠,经过3次免疫后在小鼠血清中检测到相应的抗体,抗体效价为1:12000;用杂交瘤细胞技术制备出一株抗钙调蛋白的单克隆抗体细胞株2C3;酶联免疫吸附法(ELISA)测定结果证实钙调蛋白结合稀土离子前后对该抗体的识别能力存在显着差异,表明该抗体可以用于进一步研究金属离子对钙调蛋白构象变化及其对靶分子识别的影响。     

人脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化及特性

人脑纹状体及部分丘脑AChE在低盐缓冲液中以1％Triton X-100溶脱后,经Con A、短臂及长臂凝胶配基亲和层析纯化在还原条件下SDS-PAGE呈一主带,纯化的AChE比活性可达3384U/mg,产率20％,其单体分子量66 kD,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示有单体及二、四、六、八聚体存在,等电点在pH5.3—6.0之间,人脑AChE活性大部分能用Con A亲和层析法回收说明为糖蛋白,纯化的人脑AChE与抗电鳐电器官AChE单克隆抗体3F3无抗原抗体反应,而与IH11及2G 8有弱的交叉反应,以Con A及短臂凝胶配基亲和层析纯化的人小脑AChE为抗原免疫Balb/c小鼠产生的抗血清与电鳐电器官AChE有较强的免疫交叉反应而与人红细胞膜AChE反应较弱,纯化的人脑AChE经还原羧甲基化及TPCK处理的胰蛋白酶切割后,再用反相HPLC分离,显示几个大肽峰及许多小肽峰,几个大肽峰以ELISA法测定有抗原性。     

人工雌激素己烯雌酚酶联免疫分析方法的建立

本实验旨在初步建立人工合成雌激素己烯雌酚（DES）的酶联免疫吸附分析（icELISA）方法。实验首先合成了己烯雌酚的两种半抗原正丁酸己烯雌酚单醚（DES-CP）、乙酸己烯雌酚单醚（DES-CME）。DES-CP与牛血清蛋白（BSA）偶联作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠并进一步制备了DES单克隆抗体，表征了单克隆抗体的亲和力和特异性。在ELISA优化的条件下，方法的抑制中浓度为 IC₅₀＝9.8 ng/mL，检测限 IC₂₀＝2.3 ng/mL，工作浓度范围为 2-42 ng/mL. 抗体与己烷雌酚、双烯雌酚的交叉反应分别为 44%, 27%，与天然雌激素雌二醇的交叉反应小于0.1%. 评估了分析缓冲液中盐离子浓度、pH、有机溶剂含量等因素对分析方法的影响。本分析方法应用于水样的添加实验，回收率符合分析精度要求。HPLC法对实验结果进行了确证，证明了ELISA应用于水样分析的可靠性。     

氟甲喹单克隆抗体制备、鉴定及间接竞争酶联免疫吸附分析法

以氟甲喹(FLU)为原料,合成4个碳原子手臂的半抗原(FLUABA),采用活泼酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫抗原,通过免疫Balb/c小鼠及细胞融合,获得1株稳定分泌抗氟甲喹单克隆抗体的杂交瘤细胞株DB6-E7,其抗体亚类为IgG1,亲和力常数(KA)为8.19×108L/mol。将氟甲喹、FLUABA及6个碳原子手臂的半抗原FLUACA分别与卵清白蛋白(OVA)偶联作为包被抗原,研究异源包被对间接竞争ELISA灵敏度的影响。结果表明,异源包被可显著提高ELISA方法的灵敏度。基于最佳异源包被(FLU-OVA)的酶联免疫吸附分析法的IC50为26.33μg/L,检出限为4μg/L,定量检测范围为8.0～114μg/L(IC20～IC80)。与喹诺酮类药物及结构类似物几乎不存在交叉反应,特异性高。此方法可满足畜禽产品中氟甲喹残留的快速筛查。     

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮

建立了检测氯胺酮的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)。实验最佳测定条件:抗原包被浓度为2.0mg/L、氯胺酮单克隆抗体浓度为10.2mg/L,生物素化羊抗小鼠IgG(Biotin-IgG)和酶标链霉亲和素(SA-HRP)的最佳反应浓度分别为0.29和1.0mg/L。在此优化条件下,方法的线性范围为0.1～1000μg/L;检出限为0.03μg/L。氯胺酮生物样品的加标回收率为94%～102%。与酶标二抗体系ELISA法相比,BA-ELISA具有更高的灵敏度,适于低浓度氯胺酮的检测。     

吡虫啉的酶联免疫吸附分析方法研究

通过碳二亚胺法将吡虫啉交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原,混合酸酐法将吡虫啉交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原,免疫Balb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、筛选、克隆,得到抗吡虫啉单克隆抗体,抗体亚类为IgG1,制备的单克隆抗体效价达1×107,确定了吡虫啉酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的最佳工作条件,建立了定量测定吡虫啉的间接竞争ELISA方法。本方法的IC50为(15.12±1.28)μg/L,检出限为(1.76±0.02)μg/L。与其它吡虫啉结构类似物无交叉反应。批内相对标准偏差为4.5%;批间相对标准偏差5.1%,饮用水、重庆理工大学地下水和重庆市花溪河地表水平均添加回收率分别为102%,97%和85%。本研究建立了一种快速检测环境水中吡虫啉残留的方法。     

波形蛋白-核酸复合物诱导的多特异性单抗

本文首次采用中间纤维波形蛋白(vimentin)-核酸复合物免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备了一组多特异性单克隆抗体(polyspecific McAb),这些抗体能够分别与波形蛋白、DNA、磷脂以及其它生物化学结构不同的生物大分子结合,其抗原特异性与病人血清中的自身抗体(autoantibody)极为相似。抗原表位分析结果表明,抗体所识别的波形蛋白NH_2末端恰是波形蛋白结合DNA的位点。多特异性单抗的研制将为研究抗体交叉反应机制、自身抗体来源以及核酸与蛋白质的相互关系提供了一条新的途径。     

噬菌体展示肿瘤异性抗原表位的初步免疫活性研究

利用噬菌体展示技术将丝噬菌体（fd)基因8克隆入pKK233-3质粒中，将人的恶性黑色素瘤的抗原表位基因插入到修饰后的质粒载体中，制备了含有抗原表位的杂合噬菌体。利用纯化的表位抗原免疫小鼠，用间接ELISA方法采用双波长（450/630nm)动态检测抗体。结果表明，噬菌体-表位抗原刺激小鼠产生了抗体。抗体的含量随时间不断增加，到4周进达到高峰。小鼠脾淋巴细胞转化实验表明噬菌体-表位抗原产生了明显的淋巴细胞增殖反应，为研制肿瘤疫苗奠定了基础。     

新城疫病毒流式微球免疫检测新方法

本研究基于新城疫病毒多克隆抗体的制备及优化,以聚苯乙烯微球作为蛋白质载体建立免疫检测体系,建立了快速检测新城疫病毒的流式细胞术新方法。以藻红蛋白荧光染料对新城疫多克隆抗体荧光标记,取1μL荧光微球与100μL新配制的单克隆抗体溶液反应,依次加入一定量待测抗原和藻红蛋白标记的多克隆抗体,漩涡振荡10s,室温振荡反应充分,形成双抗体夹心复合物,用流式细胞仪进行检测。采用ELISA法对免疫试剂进行了匹配性筛选实验,优选了试剂用量,并与传统ELISA方法进行了对比分析。实验结果表明,单克隆抗体350mg/L、多克隆抗体300mg/L时可获得最佳分析效果,与传统的ELISA方法呈现出良好的相关性,不与鸡传染性支气管炎病毒、鸡痘病毒、鸡马立克氏病病毒等发生交叉反应。     

基于高特异性单克隆抗体的间接竞争ELISA检测食品中胭脂红的研究

该研究设计合成了一种胭脂红半抗原,分别采用重氮化法和戊二醛法将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原,通过免疫Bal b/c小鼠及杂交瘤技术成功筛选制备了胭脂红高特异性单克隆抗体,与苋菜红、柠檬黄等结构类似物无交叉反应.基于该抗体建立了间接竞争酶联免疫分析方法用于检测食品中胭脂红残留.该方法对胭脂红的半抑制浓度(IC50)和...     

磺胺类药物单链抗体的制备及其与磺胺噻唑相互作用研究

抗体与对应的小分子待测物之间的相互作用模式决定了免疫分析的特性。本研究以磺胺类药物杂交瘤细胞株4C7为起点,应用基因工程技术制备出单链抗体scFv4C7,采用间接竞争ELISA法对比其与母本单克隆抗体的识别特性,同时采用同源建模构建scFv4C7的三维立体结构,并与磺胺噻唑( STZ)进行分子对接。间接竞争ELISA结果显示scFv4C7保留了亲本单克隆抗体的识别特性,分子对接结果显示STZ深陷入抗体的重链和轻链形成的“口袋”中,STZ分子更靠近重链,且主要与抗原互补决定区CDR H3相互作用。本研究为制备识别谱更广、亲和力更高的磺胺类药物抗体提供了必要的结构信息。     

滴滴涕单克隆抗体的制备及其评价

以滴滴涕(DDT)的特征部分为基础设计并合成了半抗原4-{4-[2,2,2-三氯-1-(4-氯-苯基)-乙基]-苯基}-丁酸(DDT-H1)、4-[4-(2,2,2-三氯-1-对甲苯基-乙基)-苯基]-丁酸(DDT-H2),并采用活泼酯法制备免疫原DDT-H1-BSA,以及混合酸酐法制备包被原DDT-H1-OVA、DDT-H2-OVA;用DDT-H1-BSA对小鼠进行免疫,通过细胞融合、筛选、克隆等步骤得到1株能稳定分泌DDT农药抗体的单克隆细胞株。细胞株经扩大培养后,注射小鼠体内产生腹水,并将其用辛酸-硫酸铵和protein A柱子纯化出单克隆抗体。其分泌的单克隆抗体免疫球蛋白亚类为Ig G1,单抗腹水的效价为1.68×105,亲和力Ka为5.238×1011L·mol-1,与其它几种代谢物有一定的交叉反应。在此基础上,利用获得的单抗研究建立DDT的间接竞争酶联免疫吸附检测法(ic ELISA)。结果表明,所建立的间接竞争ELISA方法的线性范围(IC20~IC80)为6.6~521.8 ng/m L,可用于检测农副产品、环境中残留的DDT及其代谢物。     

满江红鱼腥藻单克隆抗体的制备和应用研究

建立了40株分泌抗满江红鱼腥藻特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。 根据免疫荧光抗体试验,40个McAb分为8个类型。这8类McAb将采自世界名地的195个品种(系)满江红的体内鱼腥藻分为8个抗原群。 McAb对人工萍藻共生体和杂交满江红体内鱼腥藻的鉴定结果表明,人工萍藻共生体的鱼腥藻保持其在供体满江红叶腔中的抗原性,杂交满江红体内鱼腥藻保持其母本满江红体内鱼腥藻的抗原性,二者都不因蕨体遗传性状的改变而发生抗原结构变异。     

两种Taqman探针的制备及荧光检测性能比较

采用固相合成法,分别合成FAM/TAMRA和FAM/BHQ2双荧光标记的Taqman探针,得到的粗产物分别采用乙醇沉淀法、离子对反相色谱法、凝胶过滤柱脱盐法纯化.采用实时荧光PCR法,分别从感染的南瓜果实中检测到黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV),扩增曲线表明采用该实验条件制备的探针检测性能良好.在相同荧光PCR反应体系...     

集成免疫磁珠富集和免疫层析的黄曲霉毒素M1快速检测法

以喷涂了检测抗原黄曲霉毒素M1-BSA和驴抗鼠二抗形成检测线和质控线的硝酸纤维膜制备免疫层析试纸条,采用EDC/NHS法制备偶联了抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的免疫磁珠。免疫磁珠与待检样本混合,经捕获、磁分离后,浓缩重悬液直接用免疫层析试纸条检测,首次建立了集浓缩样本与免疫层析于一体的黄曲霉毒素M1快速检测法。该方法用于检测原料乳中黄曲霉毒素M1,检出限为0.1μg/L,低于我国制定的黄曲霉毒素M1限量标准(0.5μg/L),与其它真菌毒素和原料乳中常检违法添加物无交叉反应,分析结果与酶联免疫吸附法(ELISA)结果一致。本方法适合现场快速检测原料乳中黄曲霉毒素M1。