hKv4.3基因5'非翻译区序列S160功能分析

hKv4.3基因是形成瞬时外向钾电流Ito的主要分子基础, 它在心脏和神经细胞中大量表达, 但在其它组织中则未见大量表达. 为了研究hKv4.3表达在基因水平的调节, 将hKv4.3基因的5'非翻译区的一段序列(+2~+160, 称之为S160)克隆到报告质粒中, 进行瞬时表达. 发现S160对hKv4.3基因的启动子和SV40的启动子都有强烈的抑制作用, 没有方向特异性, 但却有位置特异性. 经删除突变分析, 在S160片段中发现了一个抑制元件S(GAGGGGTTAA), 它位于hKv4.3基因中转录起始位点下游20-30 bp处. 在此基础上, 用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析, 初步确认这个抑制元件对蛋白表达的抑制过程是在翻译水平上.     

hKv4.3基因5＇非翻译区序列S160功能分析

hKv4.3基因是形成瞬时外向钾电流Ito的主要分子基础,它在心脏和神经细胞中大量表达,但在其它组织中则未见大量表达。为了研究hKv4.3表达在基因水平的调节,将hKv4.3基因的5＇非翻译区的一段序列（＋2～＋160,称之为S160）克隆到报告质粒中,进行瞬时表达。发现S160对hKv4.3基因的启动子和SV40的启动子都有强烈的抑制作用,没有方向特异性,但却有位置特异性。经删除突变分析,在S160片段中发现了一个抑制元件S（GAGGGGTTAA）,它位于hKv4.3基因中转录起始位点下游20～30 bp处。在此基础上,用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析,初步确认这个抑制元件对蛋白表达的抑制过程是在翻译水平上。     

hKv4.3最小功能启动子区与上游抑制元件分析

通过克隆hKv4.3的启动子区和相关的上游调控元件,对hKv4.3基因在转录水平的调控进行了分析.对启动子区5'端一系列的删除突变分析证明,hKv4.3基因的最小功能启动子区是位于转录起始位点附近的-156～+2bp序列.经序列分析发现,这个启动子缺乏典型的TATA-box,却存在另外3个元件,即E-box(CANNTG),CArG-box[CC(A/T)₆GG]和CACC-box(GGTGC),其中CArG-box对该启动子活性起关键作用.同时在启动子区找到一个未见报道的大小为10bp的抑制子T,删除抑制子T,则启动子活性增加1倍以上.     

人工合成杆状病毒后期启动子的探讨

本文以苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica Nuclear PolyhedrosisVirus,AcNPV)多角体、p10、病毒粒子衣壳和核心碱性蛋白启动子的保守序列为基础,设计合成杆状病毒后期启动子——92和96碱基的互补寡聚核苷酸,并以此重组出5株在多角体启动序列、翻译起始密码子ATG上游-92处,分别或同时插入反方向的合成和多角体启动子,以及氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因的AcNPV毒株,探讨了带这些启动子的CAT在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中的表达规律及多角体基因对其表达的影响。形成多角体的重组病毒株AcNPV-vⅪⅤⅥ~+CAT和AcNPV-vSⅪⅤⅥ~+CAT中,处于合成启动子与多角体ⅪⅤ启动顺序下游的CAT基因在细胞中的表达量,要比只在多角体启动子带动下高3倍。     

肿瘤抑制因子WT1对人的诱导型一氧化氮合成酶基因的转录调节作用

将人的诱导型一氧化氮合成酶(hiNOS)启动子构建在带荧光素酶基因的载体pGL3-basic上, 构建成用荧光素酶为系统的启动子, 以研究载体p8.3iNOS. 结果显示, 肾母细胞肿瘤抑制因子(WT1)能够有效地抑制hiNOS启动子的转录; 且WT1的4个选择性剪接本的抑制效果有所不同, 其中WT1(-/-)在两种肝癌细胞(HepG2和Hep3B)中对hiNOS的表达均具有最强的抑制作用, 并且抑制效果具有剂量依赖性, 用Western blot检测结果进一步证实HepG2细胞中WT1(-/-)过量表达能下调hiNOS表达. 以上结果说明WT1在肝癌细胞中对人的hiNOS具有转录调节作用.     

阴沟肠杆菌固氮调节操纵子nifLA启动子的结构及其氧敏感性

阴沟肠杆菌E26带有与肺炎克氏杆菌同源的、排列类似的固氮基因簇。我们测定了E26固氮调节操纵子nifLA启动子区的核甘酸序列及其转录起始点。据此,构建一个E26 nifL’-lacZ翻译水平融合质粒,在大肠杆菌中测定其表达调节。结果表明,有氧培养条件下,E26 nifLA启动子的活性受到抑制,与肺炎克氏杆菌nifLA启动子相似。比较E26与肺炎克氏杆菌nifLA启动子区的核苷酸序列,显示出它们具有保守的σ~(54)启动子-24/-12区,转录起始点下游NifA结合区,以及类似的NtrC结合区结构。此外,在NtrC结合区和-24/-12区之间,揭示出一段11bp的保守序列。推测11bp保守区也许与nifLA启动子氧敏感有关。     

苜蓿根瘤菌多拷贝固氮基因启动子对根瘤发育的抑制

以荧光素酶基因作为报道基因研究苜蓿根瘤菌nif/fix基因在根瘤发育过程中的激活,发现多拷贝的nifHDK启动子和fixABCX启动子抑制根瘤的发育和固氮活性,与nifA突变型的表型相同.用β-半乳糖苷酶基因作为报道基因得到同样的结果。但是低拷贝的nifHDK启动子或fixABCX启动子对根瘤发育和固氮活性没有影响。固氮基因启动子的多拷贝抑制效应进一步说明nifA产物除了作为共生固氮基因转录的正调节因子外,对根瘤的发育也有作用。     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

人尿激酶原在CHO细胞中的基因扩增与高效表达

本文通过基因共转染和基因共扩增方法,在SV40病毒晚期启动子控制下成功地在中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-DHFR~-)中高效表达了人尿激酶原,其表达水平在5×10~(-6) mol/L氨甲喋呤存在下可达2—3μg/10~6细胞/24 h。采用PMA诱导可将表达水平提高至3.5—4μg/10~6细胞/24 h。相应的Pro-UKcDNA在细胞基因组上整合的拷贝数为200—300拷贝/细胞。Western blot分析表明,表达出来的重组Pro-UK与天然Pro-UK具有相似的分子量:S_(2444)测活法证明重组Pro-UK具有体外酰胺水解活性。     

p16基因甲基化的芯片定量检测

p16基因的失活与多种肿瘤相关,但p16基因缺失率较低,突变更为罕见,p16基因启动子区CpG岛甲基化与其蛋白表达密切相关．DNA甲基化已成为目前研究的热点,现有的技术包括：Southernblot法、限制性内切酶-PCR法、DNA测序法、甲基化特异性PCR(MSP)、     

双龙方组分诱导大鼠BMSCs分化的差异基因筛选及聚类分析

利用基因芯片筛选双龙方有效组分(总人参皂苷及总丹酚酸)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)类心肌细胞分化过程中的差异表达基因, 并对其进行聚类分析, 在基因水平研究了双龙方组分对大鼠BMSCs分化的影响. 对大鼠BMSCs进行分组培养, 分别收集10, 20, 30及40 d的细胞样本, 提取tRNA, 经基因芯片检测, 筛选出BMSCs变化过程中的差异表达基因并进行生物信息学分析, 同时通过差异表达基因对样本进行Hierarchical聚类分析. 在BMSCs的分化过程中, 筛选出179条差异表达基因, 经分析发现它们与能量代谢和信号传导等多类基因密切相关. 对样本进行聚类分析发现其聚为两大类: 10和20 d的样本聚为一类, 30和40 d的样本聚为一类. 说明BMSCs在20~30 d之间可能发生了显著的改变.     

基于分子信标定量检测肿瘤细胞p21 mRNA表达变化

根据p21基因序列设计合成特异性检测p21 mRNA的分子信标, 发展了一种体外快速、定量检测p21 mRNA的新方法, 将其用于肿瘤细胞p21 mRNA表达水平的检测. 结果发现: 抑制p53表达引起CNE2细胞中p21 mRNA表达水平降低, 转染ING1诱导MCF-7细胞中p21 mRNA表达上调, 5-氟尿嘧啶处理MCF-7细胞后p21 mRNA表达水平呈浓度和时间相关性变化. 这种特异性强、操作快速、简便的新方法有望广泛用于各类样品中p21 mRNA表达水平检测.     

带肝细胞受体结合区的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白性质的研究——形成表面抗原颗粒和在不同细胞中的分泌

我们用定向缺失突变和体外重组法构建了含有肝细胞受体结合区的乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(S蛋白)基因。该基因在猴肾细胞COS-M6中的表达产物(S309蛋白)能形成表面抗原(HBsAg)颗粒并分泌出细胞。它在细胞和培养液中稳定,并能分别被抗HBsAg和抗preSl区的抗血清所沉淀。CsCl密度梯度分析显示S309蛋白形成颗粒的密度比S蛋白略大(1.25g/ml)。S309蛋白在肝癌细胞株中容易分泌,分泌量和S蛋白相近。但它在COS-M6细胞中的分泌和肝细胞株相差悬殊,分泌量只有10％左右,而且在培养液中出现较迟。和S蛋白的同时表达则能明显地提高它的分泌效率。     

信号肽对OPMA在枯草杆菌中的分泌表达及其催化活性的影响

将编码枯草杆菌BS168的amyE信号肽(S)的基因与编码多功能淀粉酶OPMA-N和OPMA-G的基因重组, 分别构建了分泌表达多功能淀粉酶OPMA-N和OPMA-G的重组载体pMA5-OPMA-SN和pMA5-OPMA-SG, 并分别在枯草杆菌BS168中实现了OPMA-SN和OPMA-SG的有效分泌表达.SDS-PAGE分析表明, 该信号肽的引入提高了异源蛋白的分泌量, OPMA-SN和OPMA-SG的分泌水平(53%和67%)比OPMA-N和OPMA-G(45%和58%)明显提高, 但此信号肽在分泌表达OPMA-N或OPMA-G后不能被有效切除.活力分析表明, OPMA-SN(5.17 U/mg)和OPMA-N(4.57 U/mg)的活力水平与分泌水平一致, 但OPMA-SG(4.50 U/mg)和OPMA-G(4.65 U/mg)的活力水平却与分泌水平呈反相关性.通过分析OPMA-SN和OPMA-SG分子的空间构象发现, 信号肽的存在不影响OPMA-N的活性部位构象, 但影响OPMA-G的活性部位构象, 从而导致OPOMA-G的催化活性下降.     

汉坦病毒嵌合基因G2S0.7与CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的:构建含有汉坦病毒M基因(编码糖蛋白G2)和部分S基因(编码核蛋白主要抗原区段)以及S基因的多个CTL表位的多种蕈组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究.方法:构建含目的基因的重组腺病毒载体,并在VeroE6细胞中进行表达,利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、微量细胞中和试验、T淋巴细胞增殖实验及CTL杀伤实验等方法检测免疫反应.结果:成功表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效诱导针对汉坦病毒NP及GP的体液免疫应答和细胞免疫应答;同时我们发现含有CTL表位的重组腺病毒比不含CTL表位的重组腺病毒可以诱导小鼠产生更为有效的细胞免疫反应.结论:构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力.     

极端嗜盐古生菌启动子序列缺失突变的微量热研究

用微量热方法和DNA缺失突变技术研究了来源于极端嗜盐古生菌R1上的一个推测的启动子片段(RM10)在大肠杆菌中的启动子功能. 启动子片段融合到质粒pKK232-8上无启动子的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因前来检测它驱动基因表达的能力, 缺失分析RM10启动子片段定位具有启动活性的重要功能区. 实验结果从热动力学角度揭示, 这个启动子片段上含有－35区和－10区特征的1382～1517 bp(碱基对)区段是它在大肠杆菌中具有启动子功能的关键部分; 在1～1382 bp区段或1571～1848 bp区段上还存在它的负调控区. 该研究为基因启动子功能研究提供了一种新的、更加灵敏便捷的、化学与生物学相结合的方法.     

人类端粒DNA的分子识别及其作用机制探讨

核酸中富含短的G-碱基重复的序列可以形成一种复杂的高级结构,称为G-四链体（G-quadruplex）.在基因组中,借助生物信息学发现这类富G序列广泛分布在基因的启动子区,特别是那些参与到复制中去的基因,例如癌基因.同时发现这类序列在mRNA的5′非翻译区（5′UTR）也广泛存在.这类序列在染色体末段端粒部位的存在及功能已得到充分阐明.已知端粒富含G-碱基序列,其3′末端以单链状态存在,这使得在一些小分子的选择性作用下端粒序列很容易形成G-四链体结构,进而破坏端粒结构,影响端粒酶活性.已知端粒酶在超过85%的肿瘤中过量表达,因此,端粒酶已经成为抗癌药物设计的特殊靶点,是目前本领域的研究热点之一.已发现系列配体通过有效抑制端粒酶而表现高的抗肿瘤活性.本文主要综述了近年来端粒G-四链体分子识别及其药物靶向的最新进展,并对其作用机理做了进一步的分析和探讨.     

乙型肝炎病毒核心抗原基因结构对其在大肠杆菌中表达的影响

本文将含乙型肝炎(以下简称乙肝)病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)基因的1kbHhaI酶切HBV·DNA片段用BAL-31外切酶切除两端非编码区,连接EcoRI合成接头后插入到载体pUR222的EcoRI位点,转化受体菌后筛到一系列不同HBcAg表达水平的重组体。分析高表达和低表达重组体工作中,发现在同一乳糖启动子、核糖体结合部位(SD序列)和Lac Z基因N端第5氨基酸后连接的HBcAg基因,由于在ATG5′端上游—7至—35核苷酸区有一呈部分迥文的序列,当转录成mRNA时可形成一环茎二级结构,是否用BAL—31酶切除此结构对表达水平影响极大。高表达重组体HBcAg产量可占菌体总蛋白9％,低表达的只为其千分之一。本文并对此现象在原核细胞中表达真核基因的意义进行了讨论。     

人组织型纤溶酶原激活剂表达调控及高效表达的研究——Ⅰ.t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控

运用分子剪切技术构建了含不同长度3′端非翻译区(3′-UTR)的t-PAcDNA克隆,体外转录的mRNA在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达的结果表明t-PA mRNA 3′-UTR序列对其表达有明显抑制作用,3′-UTR缺失使t-PA表达水平提高3—8倍。进一步研究表明,t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的抑制是由3′末端长约200nt的富含AU序列所致。RNA稳定性试验证实这段富含AU的序列使t-PA mRNA稳定性下降3倍以上;将该序列插入荧光素酶(Luc)基因3′-UTR,使Luc的表达水平明显降低。分析了该序列调节t-PA表达的可能机理,提出了调控的模式。     

高效抗虫转基因烟草的研究

苏云金杆菌HD-1的杀虫蛋白基因经5′端改造,3′端进行4种不同长度缺失后插入到含有双增强子的35S启动子,翻译增强子“Ω′”片段的双元载体中,借助土壤农杆菌LBA 4404将在此双元载体上的杀虫蛋白基因及新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)转入到生产品种烟草NC89的染色体上,从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用1—3龄烟青虫对这些转化植株进行大量重复虫试结果表明用4种不同长度B.t.基因转化的再生植株中都有抗虫性高的植株,其中以1.8kb的B.t.Cry IA(c)基因转化的植株杀虫效果最好,这一组转基因植株的平均杀虫率在90—100％的约占该组总虫试植株的50％。对高抗虫性植株的子一代(T1)和子二代(T2)进行遗传分析,分子生物学分析和进一步的抗虫试验表明B.t.基因已遗传到子代并初步选到了高抗虫性的转基因纯合株系D8-14和D19-8等。