双光子激发时间分辨荧光光谱测量技术

建立了一台基于高重复频率扫描相机的双光子激发时间分辨荧光光谱测量系统，能够同时测量样品的荧光光谱和寿命. 该系统的时间分辨率为6.5—200ps，光谱分辨率为1—3nm，能够实现快速数据采集以及可靠和可重复的寿命和光谱测量. 利用标准荧光染料(若丹明6G、香豆素314)及其混合溶液对该系统进行了测试，所得到的荧光光谱分布和寿命值与文献报道一致. 实验结果表明，该系统能有效区分多组分荧光团. 这为鉴别多荧光团或多组分生物组织提供了一种独特的对比方法，可用于多光谱分辨荧光寿命成像和荧光共振能量转移成像等方面. 关键词： 荧光寿命 荧光光谱 双光子激发 高重复频率扫描相机     

激光诱导时间分辨固体表面荧光光谱系统

采用斜射式激发样品光路结构,设计了应用于测试时间分辨固体表面荧光光谱系统。利用该系统研究了氧化锌薄膜在355 nm激光脉冲激发下的时间分辨固体表面荧光光谱。结果表明,该系统能够实现测量时间分辨固体表面荧光光谱,并由此测量了样品的固体表面荧光寿命。该系统结构简单可靠,灵敏度高,响应速度快。     

用于双光子激发荧光寿命显微成像的高重复频率皮秒扫描相机

建立了一台基于新研制的高重复频率皮秒扫描相机的双光子激发荧光寿命显微成像系统,重点介绍所研制的高重复频率皮秒扫描相机。为了在高时间分辨力的同时扩大时间测量范围,实现大面积两维空间高时间分辨取样测量,从而提高采样速率和更有效地发挥扫描相机的作用,设计和研制了一种大面积、高时间分辨力扫描变像管和一种重复频率高达1MHz的斜坡电压扫描电路。基于上述关键部件所研制的扫描相机具有重复频率高、扫描速度可调、时间分辨力高、工作面积大、非线性低、触发晃动小等优点。用钛宝石飞秒激光器作为激光脉冲源,通过脉冲提取器将76MHz的高重复频率降低为1MHz,采用可调延时器和标准具对扫描相机的时间分辨力、扫描速度和非线性进行标定。该系统的时间分辨力达到6.5ps,非线性为2.60%,可测量的时间范围从十几皮秒到几十纳秒。测量了若丹明6G和香豆素314两种标准荧光染料的荧光寿命,取得了与参考文献一致的实验结果。     

机油产品激光诱导荧光特性的研究

利用紫外脉冲激光和光电倍增管相结合测量机油产品激光诱导荧光的光谱特性和时间特性.分析了荧光光谱的产生,给出了时间分辨荧光光谱的测量.实际测量了一种应用广泛的燕山机油的时间分辨荧光的光谱分布和荧光寿命,测得的荧光谱分布结果和文献中报道的相同.     

铂原子高激发态能级自然辐射寿命测量研究

运用时间分辨激光诱导荧光技术和激光诱导等离子体方法测量了铂原子的15条奇宇称高激发态能级的自然辐射寿命.测量结果处于6.1到116 ns之间,且误差低于10%.经比较,与前人结果在误差范围内符合很好.据文献调研所知,结果中有5条高度接近60000 cm~(-1)的高激发态能级的寿命值是未见报道的.     

眼底视网膜色素上皮层细胞脂褐素及氧化黑色素自体荧光寿命成像研究

利用一种基于时间相关单光子计数器的双光子激发荧光寿命显微成像技术，对猪眼底视网膜色素上皮层细胞内的脂褐素和氧化黑色素颗粒的空间分布及其荧光寿命特性进行了研究，尤其对于这些色素颗粒在光致氧化环境中的荧光寿命差异进行了分析.结果表明，利用荧光寿命测量能有效区分视网膜色素上皮层细胞中的多组分荧光团，利用荧光寿命的衰减参数可分辨正常及异常的荧光现象.该方法有望发展成为一种用于眼科临床诊断及病理学研究的高灵敏度的工具，对眼底细胞随年龄增长的衰老机理的研究具有重要的意义.     

农药荧光寿命测试系统的原理与设计

介绍荧光的产生、荧光寿命的产生机理以及荧光寿命测量的基本原理。设计了一种利用直接记录法(光子计数法)测量农药荧光寿命的测试系统。该系统针对待测样品的特性，选用了相应的脉冲光源、光学元件和半导体探测器等器件，优化了各器件的工作参数，进行了简易而又科学的模块化设计，并对西维因农药的荧光寿命在无激励光干扰情况下进行了实际测试，测得了西维因溶液在500μg／L浓度时的荧光衰减曲线和荧光寿命(0.30～0.40ns)。结果表明，该系统具有结构简易、操作方便的优点，能测量100ps级的荧光寿命，适合于对能发荧光的农药进行荧光寿命的定量测量。     

眼底视网膜色素上皮层细胞脂褐素及氧化黑色素自体荧光寿命成像研究

利用一种基于时间相关单光子计数器的双光子激发荧光寿命显微成像技术,对猪眼底视网膜色素上皮层细胞内的脂褐素和氧化黑色素颗粒的空间分布及其荧光寿命特性进行了研究,尤其对于这些色素颗粒在光致氧化环境中的荧光寿命差异进行了分析.结果表明,利用荧光寿命测量能有效区分视网膜色素上皮层细胞中的多组分荧光团,利用荧光寿命的衰减参数可分辨正常及异常的荧光现象.该方法有望发展成为一种用于眼科临床诊断及病理学研究的高灵敏度的工具,对眼底细胞随年龄增长的衰老机理的研究具有重要的意义. 关键词： 双光子激发荧光 荧光寿命成像 视网膜色素上皮层     

基于时间分辨荧光光谱法同时测定己酸乙酯与乙酸乙酯

提出了一种基于时间分辨荧光光谱分析法同时测定己酸乙酯和乙酸乙酯混合液中各组分浓度的方法。实验测得两种单体物质的荧光发射光谱重叠度达到78%。对于荧光发射光谱重叠度很高的物质使用普通荧光方法结合算法也很难进行定量分析。而通过量子化学计算结果,对两种单体的分子结构分析,得到己酸乙酯的荧光寿命长于乙酸乙酯。通过时间分辨荧光光谱测量得到己酸乙酯和乙酸乙酯的荧光寿命分别为1.0和5.3 ns。两种物质的荧光发射光谱重叠严重,但是其荧光衰减曲线有明显的差别,所以提出使用时间分辨荧光光谱法对两种物质进行定量分析。通过分析两种物质不同体积比下的荧光衰减曲线的变化趋势,建立两种物质体积比的预测模型,并对其进行检验。实验结果表明：该方法能够实现混合溶液中各组分体积比的测量,其测量的平均残差控制在1%以内,具有一定的实用价值。     

基于超短脉冲的癌细胞荧光光谱

研究用于癌症诊断与治疗的光敏剂血卟啉(hematoporphyrin derivative,HPD)的超快光动力学过程。采用超短脉冲激光光谱技术和皮秒时间相关单光子计数系统,测量经血卟啉培养的活体癌细胞与正常细胞的荧光光谱、荧光寿命特性及荧光峰值强度随时间的变化,观测到:癌细胞样品在645nm处具有特征发射光谱峰;癌细胞与正常细胞样品荧光寿命的快成分分别为150,300ps;癌细胞与正常细胞的荧光峰值强度经12h分别衰减10%和55%。对测量所得的荧光光谱曲线及时间分辨荧光衰减曲线分析,计算出:在癌细胞内部血卟啉浓度增大了约2个数量级;癌细胞与正常细胞的荧光寿命分别为824,1798ps;血卟啉在癌细胞与正常细胞样品中滞留时间分别为17,6d。测量结果确认了荧光光谱技术诊断与治疗癌症的可行性,并对发展超短脉冲激光光谱技术早期诊断与治疗癌症具有重要的指导意义和临床应用价值。     

Fluorescence lifetime tomography of live cells expressing enhanced green fluorescent protein embedded in a scattering medium exhibiting background autofluorescence

We present a novel fluorescence lifetime tomography system applied to a highly scattering autofluorescent phantom containing live cells expressing the fluorophore enhanced green fluorescent protein (EGFP). The fluorescence signal was excited using a fiber-laser-pumped supercontinuum source and detected using wide-field time gating imaging. To facilitate rapid 3D reconstruction of the fluorescence lifetime distribution, the time-resolved data were Fourier-transformed in time to give complex functions that formed a data set for the Fourier domain reconstruction. Initially the presence of an unspecified background autofluorescence signal impeded reconstruction of the lifetime distribution, but we show that this problem can be addressed using a simple iterative technique.     

Photon-counting technique for rapid fluorescence-decay measurement

We report on a novel laser-induced fluorescence triple-integration method (LIFTIME) that is capable of making rapid, continuous fluorescence lifetime measurements by a unique photon-counting technique. The LIFTIME has been convolved with picosecond time-resolved laser-induced fluorescence, which employs a high-repetition-rate mode-locked laser, permitting the eventual monitoring of instantaneous species concentrations in turbulent flames. We verify the technique by application of the LIFTIME to two known fluorescence media, diphenyloxazole (PPO) and quinine sulfate monohydrate (QSM). PPO has a fluorescence lifetime of 1.28 ns, whereas QSM has a fluorescence lifetime that can be varied from 1.0 to 3.0 ns. From these liquid samples we demonstrate that fluorescence lifetime can currently be monitored at a sampling rate of up to 500 Hz with less than 10% uncertainty (1sigma) .     

单壁碳纳米管吸附联苯类有机物的荧光光谱分析

利用芳香族化合物对单壁碳纳米管进行了化学修饰,并利用荧光光谱以及时间分辨光谱对修饰后的单壁碳纳米管进行了表征分析.实验发现吸附对三联苯后有1个荧光峰位置发生了蓝移,这说明吸附过程使对三联苯的一些能级分布发生了变化.测量吸附前后对三联苯和蒽甲醇的荧光寿命,发现吸附后的荧光衰减曲线下降趋势更加明显,对曲线进行多指数拟合得出的荧光寿命及其数目发生了变化,分析了可能导致该现象的原因.     

激光诱导叶绿素荧光寿命的测量及其特性分析

提出了一种用于评估植物生长状况及环境监测的激光诱导叶绿素荧光寿命测量方法. 采用波长355 nm的激光作为光源激发叶绿素荧光, 由光电倍增管接收其荧光信号, 由于被测叶绿素荧光衰减函数与激光脉冲、仪器响应函数卷积在一起, 根据它们的特性, 运用时间分辨测量法分别测得叶绿素荧光及其背景信号, 并结合一种新型解卷积算法可分离出真实的叶绿素荧光衰减函数, 从而获取叶绿素的荧光寿命. 测试结果表明: 该方法能够实现叶绿素荧光寿命的高精度实时监测, 对不同叶绿素含量的溶液荧光寿命进行了测试, 证明叶绿素含量与其荧光寿命具有相关性, 并且拟合了叶绿素含量与荧光寿命的标定曲线. 关键词： 荧光寿命 激光诱导荧光 时间分辨测量法 叶绿素含量     

基于激光诱导叶绿素荧光寿命成像技术的植物荧光特性研究

针对植物荧光遥感探测中信号易受干扰的问题, 提出了一种用于评估植物生长状况及环境监测的荧光寿命成像技术. 采用凹透镜对355 nm波长的激光扩束, 再照射植物激发叶绿素荧光, 由增强型电荷耦合器件接收荧光信号. 采用时间分辨测量法, 连续用相同激光脉冲照射植物以激发相同的荧光信号, 同时不断改变激光脉冲触发探测器启动的延时时间, 从而能够得到完整的离散荧光信号分布图像. 对植物特定位置点产生的离散荧光信号进行拟合, 再运用一种改进型的迭代解卷积法可反演高精度的荧光寿命; 进而反演图像各点的荧光寿命以生成植物的荧光寿命分布图. 该方法所绘制的荧光寿命图比荧光强度图能更准确地反映植物内部的叶绿素含量, 并对活体植物叶绿素荧光寿命的物理特性进行了初步研究, 证明叶绿素荧光寿命与植物生理状态存在一定关联; 并且叶绿素荧光寿命与活体植物所处环境存在着复杂的关系. 未来将与生物物理学家们合作, 继续探寻叶绿素荧光寿命与植物生存环境的关系.     

355 nm纳秒激光作用下荧蒽的时间分辨荧光光谱特征

多环芳烃由于具有三致(致癌、致畸、致突变)特性,其在环境中的检测受到人们广泛关注。利用时间分辨光谱技术,研究了荧蒽乙醇溶液的荧光光谱随延时时间和门宽改变的特性。研究了不同浓度荧蒽的时间分辨荧光光谱特性,以原始浓度的荧蒽为初始溶液,通过逐级稀释的方式,最终将原始溶液稀释16倍,拟合了不同稀释倍数下的荧蒽荧光强度衰减随延时时间变化的动力学曲线,得到了不同浓度荧蒽的拟合荧光寿命。研究结果表明,荧蒽的荧光光谱特性与光谱仪探测器延时时间和门宽宽度密切相关。固定延时时间,随着光谱仪门宽宽度的变化,荧蒽的荧光强度随着门宽的增大而逐渐增强。固定门宽,改变延时时间的过程中,荧蒽的荧光强度随延时时间呈现先增大,后减小的趋势。荧蒽的荧光强度随延时时间的衰减过程符合指数衰减过程,将荧蒽乙醇溶液进行逐级稀释,荧蒽荧光强度与延时时间的衰减进行指数拟合后,得到不同稀释倍数的荧蒽乙醇溶液的衰减动力学参数,随着稀释倍数的增大,拟合得到的荧蒽荧光寿命增大。多环芳烃时间分辨光谱特征的研究,可以为环境中多环芳烃的检测提供技术基础,由于不同荧光物质具有特征的荧光寿命,因此,可以利用多环芳烃与环境中其他荧光物质的不同荧光寿命特性,准确识别环境中的多环芳烃污染物。     

稀土原子与离子的自然辐射寿命测量

概述了当前自由原子和离子的激发态自然辐射寿命测量技术的进展。以LaⅠ和PrⅡ为例,系统介绍了几种稀土元素自由原子和离子激发态寿命测量技术并分析了它们的优缺点;以SmⅡ为例,详细介绍了激光烧蚀产生自由原子(离子)技术及结合激光诱导荧光时间分辨光谱技术进行激发态寿命测量的优缺点。最后,探讨了改进上述技术局限性的解决思路,以期进一步提高辐射寿命测量的精确度。     

A UV–Visible–NIR fluorescence lifetime imaging microscope for laser-based biological sensing with picosecond resolution

This article describes the design and characterization of a wide-field, time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) system developed for picosecond time-resolved biological imaging. The system consists of a nitrogen-pumped dye laser for UV–visible–NIR excitation (337.1–960 nm), an epi-illuminated microscope with UV compatible optics, and a time-gated intensified CCD camera with an adjustable gate width (200 ps-10^-3 s) for temporally resolved, single-photon detection of fluorescence decays with 9.6-bit intensity resolution and 1.4-μm spatial resolution. Intensity measurements used for fluorescence decay calculations are reproducible to within 2%, achieved by synchronizing the ICCD gate delay to the excitation laser pulse via a constant fraction optical discriminator and picosecond delay card. A self-consistent FLIM system response model is presented, allowing for fluorescence lifetimes (0.6 ns) significantly smaller than the FLIM system response (1.14 ns) to be determined to 3% of independently determined values. The FLIM system was able to discriminate fluorescence lifetime differences of at least 50 ps. The spectral tunability and large temporal dynamic range of the system are demonstrated by imaging in living human cells: UV-excited endogenous fluorescence from metabolic cofactors (lifetime ∼1.4 ns); and 460-nm excited fluorescence from an exogenous oxygen-quenched ruthenium dye (lifetime ∼400 ns). Received: 23 February 2003 / Published online: 22 May 2003 RID="*" ID="*"Corresponding author. Fax: +1-734/9361-905, E-mail: mycek@umich.edu     

时间分辨激光荧光光谱技术在免疫分析中的应用

本研究以时间分辨激发荧光光谱分析技术为基础 ,进行稀土离子标记的激光激发的时间分辨荧光免疫分析 (TRFIA)研究。实验以自行合成的二乙三胺五醋酸酐 (DTPAA)为双功能螯合剂。用 Eu3+标记兔抗人 (RAH) Ig G抗体 ,依据解离增强原理 (DEL FIA) ,研究了 Eu3+ -β萘甲酰三氟丙酮 (β- NTA)的荧光分辨体系 ,测定了荧光光谱和荧光寿命 ,建立了铕离子分析检出方法 ,其工作曲线范围为 1× 10 - 7～ 1× 10 - 1 1g· m L- 1 ,检测限为 1× 10 - 1 3g· m L- 1 ,相对标准偏差为 6 .4%。结合 TRFIA方法学研究 ,进行了人血清丙型肝炎病毒抗体 (Anti- HCV)检测。并同酶联免疫法 (EL ISA)对比。取得 TRFIA法阳性检测率明显高于EL ISA法的结果。