PCR扩增乙酰乳酸合酶基因片段的研究

实验对大肠杆菌ＰＰＡＷ－１质粒的ＤＮＡ（含乙酰乳酸合酶基因）进行了提取分离与纯化,并以此质粒ＤＮＡ为模板,用乙酰乳酸合酶基因的３个引物５′－Ｂ．ｎ．、３′－ＭＷ－１和３′－Ｂ．ｎ．,通过ＰＣＲ扩增得到了乙酰乳酸合酶基因的大片段,克服了用２个引物不能扩增合成乙酰乳合酶基因的困难．     

重组诱导型一氧化氮合酶基因转染血管平滑肌细胞及对其增殖的影响

探讨重组诱导型一氧化氮合酶基因转染血管平滑肌细胞及产生的一氧化氮对血管平滑肌细胞增殖的影响。将诱导型一氧化氮合酶基因通过真核表达载体转入血管平滑肌细胞中 ,用Griess法测定转染细胞生成的一氧化氮的量。观察转染后平滑肌细胞生长状态情况 ,用流式细胞仪分析细胞周期的变化。结果正常细胞组NO的含量为78.4 4± 1 5 .38,而iNOS转染组NO含量为 2 36 .5 7± 31 .83,两组相比有非常显著差异 (P =0 .0 0 0 ,n =6 ) ,血管平滑肌细胞转染后生成一氧化氮。转染后的平滑肌细胞生长明显受到抑制 ,主要抑制平滑肌细胞周期G1 S期的过渡 ,使细胞停留在G1期。说明血管平滑肌细胞可以成功转染iNOS基因 ,生成的一氧化氮可明显抑制平滑肌细胞的增殖 ,为从血管非内皮成分进行iNOS基因转染提供了实验研究的依据     

果实特异表达芪合酶基因的表达载体构建及农杆菌重组

本研究利用基因工程技术构建了附加果实特异表达启动子的芪合酶基因植物表达载体，并通过农杆菌直接转化技术将其转入LBA4404、EHA105，并采用PCR及限制性酶切分析对所获得的农杆菌工程菌株进行鉴定。为利用芪合酶基因转化植物并在食用果实中产生白藜芦醇做准备。     

通过S-柠檬烯合酶突变体的动力学分析揭示萜烯合酶进化的机制

使用孔雀绿比色法分析了S-柠檬烯合酶(S-limonene synthase,S-LS)野生型和突变体的动力学特性.研究表明,萜烯合酶经过引入少数残基突变合成新型萜烯化合物仍然可以保持酶的催化活性.该特性可以解释植物中是如何进化出新的萜烯合酶,从而解释了自然界中萜烯化合物的多样性.本研究提出了萜烯合酶的进化模型.同时针对生物合成中萜烯化合物产量不高的难题,为定向改造萜烯合酶提供了解决方法.     

汉滩病毒嵌合基因 G150.7 重组腺病毒免疫学特性研究

对本室已构建的汉滩病毒糖蛋白(GP)和核蛋白(NP)的嵌合基因GlS0.7重组腺病毒的免疫学特性进行研究.将汉滩病毒含有G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒直接免疫Balb/c小鼠,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测小鼠的免疫应答效果.用该重组腺病毒免疫的小鼠,可诱导产生抗汉滩病毒NP及GP特异性的抗体,抗体效价分别为1:320及1:40.同时重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应.说明所构建的汉滩病毒嵌合基因G150.7重组腺病毒,可同时刺激机体产生特异性的抗汉滩病毒体液免疫应答及细胞免疫应答.     

D-海因酶基因重组子的构建和酶的表达活性

以中华根瘤菌(Sinorhizobium morelense)SS—ori总DNA为模板，用PCR法扩增D-海因酶基因，分别克隆到5种不同的载体，并转入5种不同的Escherichia coli菌株，获得25株工程菌，进行培养与诱导表达．细胞经超声处理后，通过SDS—PAGE和酶活性两种指标比较表达产物．结果表明，除3株工程菌具有D-海因酶活性外，其它均为无酶活性的不溶性包涵体，包涵体经变性、复性后，可部分获得有活性的D-海因酶，其比活为0．90U／mg，复性率约为20％．此外，对包涵体产生的原因及可能解决办法也进行了讨论．     

蝴蝶兰查尔酮合酶基因cDNA的克隆、鉴定及其原核表达

利用逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在蝴蝶兰花瓣中特异性表达的查尔酮合酶cDNA(pchs-1)．DNA序列分析表明,该序列与已发表的查尔酮合酶基因有很高的同源性．将此cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET-24α( )原核表达载体上,经IPTG诱导后,SDS-PAGE的结果表明有预测大小的蛋白受诱导表达,该基因在植物中的功能验证工作正在进行中．     

汉滩病毒嵌合基因G2S0.7重组腺病毒免疫学特性研究

对汉滩病毒糖蛋白 (GP)和核蛋白 (NP)的嵌合基因G2S0 .7重组腺病毒的免疫学特性进行研究。将汉滩病毒含有G2S0 .7嵌合基因的重组腺病毒直接免疫Balb/c小鼠 ,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测免疫应答效果 ,以研究嵌合基因的免疫效果。结果用该重组腺病毒免疫的小鼠 ,可诱导产生抗汉滩病毒NP及GP特异性的抗体 ,抗体效价分别为 1 :1 6 0及 1 :2 0。同时重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应。说明汉滩病毒嵌合基因G2S0 .7重组腺病毒 ,既可刺激机体产生特异性的抗汉滩病毒体液免疫应答 ,也可刺激机体产生特异性的细胞免疫应答 ,本研究为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了实验基础     

试论真菌四分子分析在基因重组研究上的意义

本文讨论了真菌顺序四分子在研究基因重组方面的主要优点,并对借用真菌顺序四分子分析原理来对高等植物小孢子四分体进行类似遗传分析的可能性作了探讨。     

INO1基因在粟酒裂殖酵母中的表达及对蔗糖酶分泌和磷脂合成的影响

分别用含有INO1基因的两个质粒pADH-INO和pSPIN-22对天然肌醇营养缺陷型的粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）进行转化，得到的转化子分别命名为Sch.P944和Sch.P1025.通过对Sch.P944和Sch.P1025的研究，发现两个质粒均能在粟酒裂殖酵母中自主复制并使其变成肌醇原养型，但肌醇分泌的速度和数量Sch.P944均高于Sch.P1025。用该两菌株研究肌醇合成与细胞生长及可分泌蔗糖酶比活的关系，结果显示：细胞的生长与肌醇的合成紧密相关；而蔗糖酶的比活，当葡萄糖含量小于1％时，菌株Sch.P944的蔗糖酶分泌是解葡萄糖阻遏的，而Sch.P1025在实验范围内，蔗糖酶的比活都受到葡萄糖的阻遏作用。对Sch.P944和Sch.P1025膜磷脂的组成进行分析比较发现，膜磷脂中磷脂酰肌醇（PI）的含量Sch.P944比Sch.P1025高，而磷脂酰丝氨酸（PS）的含量Sch.P944比Sch.P1025低。这意味着肌醇通过磷脂酰肌醇参与了蔗糖酶分泌的解阻遏作用。     

查尔酮合酶基因在植物防御反应中的调控作用

论述了查尔酮合酶基因(chs)在植物防御反应中与病原物的相互关系,探讨了与查尔酮合酶因诱导表达相关的顺式作用元件和反式作用因子及其DNA-蛋白质间的相互作用,阐明其在植物抗病性防御反应中的重要作用。     

麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法,从芝田硫化叶菌B12中扩增了麦芽寡糖基海藻糖合酶基因（TreY）,扩增产物大小为2．2kb,将扩增片段与pUCm-T连接,得到重组质粒pUCm-T-TreY,CaCl2法转化DH5α,并筛选阳性克隆。用BamHI／Ndel分别双酶切pUCm-T-TreY和表达载体pET21a,连接后得重组pET21a-TreY,转化大肠杆菌DE3并进行了表达。表达产物经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为74kDa的特异条带,同核苷酸序列所推导的值相符。     

查尔酮合酶基因的克隆及双元载体的构建

以中国水仙为材料，利用RT-PCR方法克隆查尔酮合酶基因(CHS)的cDNA，核酸序列分析表明，该基因的编码区长1167bp，编码389个氨基酸，通过进一步的中间克隆，将CHS连上CaMV35s启动子和Tnos终止子。进一步将重组片段插入植物表达载体pCAMBIA1301,PCR及测序结果都证明植物双元表达载体p1301BΩＣ构建获得成功。为进一步在植物中表达CHS奠定了基础。     

虎杖白藜芦醇合酶基因转化拟南芥的研究

为验证虎杖白藜芦醇合酶基因PcRS在转基因植物中合成白藜芦醇的有效性,构建了植物表达载体pCAM1380-35S-PcRS,通过农杆菌介导,利用花序浸泡法转化拟南芥.转化子在含有潮霉素的培养基上经筛选后,利用PCR和Southerrn杂交技术检测,进一步证实PcRS基因已整合到拟南芥基因组.经过选育得到了遗传稳定的T3...     

利用PCR产物一步法敲除大肠埃希菌的外排泵基因acrAB

通过电转化将一段PCR产物引入宿主菌BW25113/pIJ790细胞内,PCR产物两端有与染色体同源的30个核苷酸序列,中间是抗生素抗性基因。pIJ790上编码λ噬菌体的3个重组蛋白:Exo、Bet和Gam组成Red重组系统,可实现线性片段的一步法高效重组,以PCR产物中的抗生素抗性基因取代靶基因。通过该方法得到了大肠埃希菌的外排泵基因acrAB敲除突变株,该菌株在抗菌物质的抗菌机制研究方面能发挥一定的作用。     

酿酒酵母蔗糖酶基因的克隆、异源表达及重组酶学性质研究

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到蔗糖酶基因(suc2),并将其克隆到表达载体pSE380中,将得到的重组质粒pSE-suc2转化进E.coli BL21中,利用镍金属螯合层析方法分析测定其酶学性质。重组菌株的SDS-PAGE结果显示重组蔗糖酶基因(suc 2)有60kDa目的蛋白出现,纯化的SDS-PAGE分析得到均一的蛋白条带;重组蔗糖酶的Km值为47.73mmol/L,最大反应速率为79.59mg还原糖mg-1蛋白min-1,最适温度为42℃,最适pH值为5.5,Zn2 、Cu2 对重组蔗糖酶酶活有较强的抑制作用,Ba2 、Mg2 、Mn2 对重组蔗糖酶酶活稍有激活作用。     

法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及双元载体的构建

以留兰香(MenthaspicataL)为材料,利用RT PCR方法克隆法呢基焦磷酸合酶基因(fps)的cDNA,核酸序列分析表明,该基因的编码区长1050bp,编码349个氨基酸.进一步将fps基因插入植物表达载体BinAR,酶切鉴定及测序结果都证明fps的植物双元表达载体构建成功,为fps基因在烟草中的异源表达奠定了基础.     

金钗石斛查尔酮合酶基因的生物信息学分析

利用生物信息学工具及方法对金钗石斛查尔酮合成酶基因进行分析。结果显示,金钗石斛查尔酮合酶基因(DnCHS)完整的CDS为1 188 bp,共编码395个氨基酸,蛋白分子量为43.10 kD,理论等电点为6.22,且该蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,很可能定位在细胞质中。同时,蛋白质二级和三级结构的分析表明,DnCHS蛋白由33.92%的α螺旋,8.35%的延伸链以及57.72%的无规则卷曲组成。系统进化分析显示,DnCHS与红掌的亲缘关系最近。     

牡丹蔗糖转运蛋白基因PsSUT1的功能研究

蔗糖转运蛋白属于MFS家族,该家族是已知最大的转运体家族。本研究采用“TA”克隆技术,从‘洛阳红’牡丹中得到牡丹蔗糖转运蛋白基因PsSUT1,基因序列全长为1 846 bp,包含1 557 bp的开放阅读框,编码519个氨基酸。进化树分析显示该基因序列在进化过程中是保守的。蔗糖转运活性试验表明PsSUT1的表达使SUSY7/ura3酵母菌株能够在蔗糖为唯一碳源的培养基上生长,说明PsSUT1编码的蛋白具有蔗糖转运活性。亚细胞定位试验结果表明该蛋白定位于细胞膜。将PsSUT1基因异源转化拟南芥,结果表明PsSUT1转基因阳性苗与野生型拟南芥相比,地上部分干重平均增加了46.35%,株高增加了50.44%,种荚数增加了40.54%;拟南芥蔗糖耐受性检测中,PsSUT1转基因植株生长正常,根系明显比野生型拟南芥植株长,叶片发育也正常,没有花青素积累。本研究为改善盆栽牡丹生长与发育状况提供分子生物学方面的理论依据和技术支撑。     

ARMS实时PCR基因分型特异性的研究

以原癌基因K-ras基因12位密码子的4种基因型(野生型为GGT,突变型为AGT、TGT、CGT)质粒DNA为研究模型,采用SYBR GreenⅠ为实时PCR指示剂,进行ARMS实时PCR基因分型特异性的研究.结果表明在和模板匹配的ARMS引物3′端附近引入故意错配碱基,将ARMS引物浓度稀释10倍,并对传统三步PCR循环进行改良,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异,在传统延伸步骤之后增加一步恒温80℃检测荧光步骤,可消除引物二聚体的影响,使ARMS引物的特异性增强,得到清晰的基因分型结果.实验表明这种基于SYBR GreenⅠ的ARMS实时PCR基因分型方法,无需合成探针,实验设计简单,是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法,可推广用于其他基因的分型,并可望成为应用于临床的基因诊断技术之一.