北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

黄颡鱼MyoD基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和RACE(cDNA末端快速扩增)方法克隆黄颡鱼MyoD(myogenic differentiation antigen,成肌分化抗原)基因的cDNA全长序列,对其进行生物信息学和在雌雄个体组织中的表达差异分析.结果表明,黄颡鱼MyoD基因编码区由810个碱基组成,编码269个氨基酸,其中第1～89个氨基酸为Basic区,第90～141个氨基酸为bHLH结构;黄颡鱼的MyoD基因与斑点叉尾鮰的同源性最高为93%.在雌雄成体组织中的表达分析显示,雄性个体中肌肉和胃组织中的表达量极显著高于雌性个体(p<0.01),雌性个体的肾脏和鳃组织中的表达量显著高于雄性(p<0.05).通过MyoD基因在雌雄个体中表现出的组织表达差异,认为这可能是造成黄颡鱼雌雄生长差异的重要因素之一.     

草鱼CCL4基因的克隆及表达

草鱼CCL4基因全长854 bp,最大开放阅读框位于104~397 bp,编码97个氨基酸,其中32~73氨基酸为其保守的CC趋化因子家族结构域,N-端有1个由24个氨基酸组成的信号肽。草鱼CCL4与斑马鱼的同源性为69%,与其他鱼类和哺乳类的同源性在50%以下。系统进化分析也显示其与斑马鱼CCL4基因的亲     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.     

半滑舌鳎DMRT 1基因的克隆与表达分析

利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的DMRT 1基因;并用RT-PCR技术检测了该基因在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼的不同组织的表达情况.结果表明,该基因cDNA序列全长1 232 bp(GenBank登录号为EU007655),包括774 bp开放阅读框,131 bp5′非翻译区以及含poly(A)信号的329 bp的3′非翻译区,编码258个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎DMRT1氨基酸序列与牙银汉鱼、黑鲷、青鳉、河豚和斑马鱼DMRT1氨基酸序列的同源性分别达到了63%、59%、54%、53%和52%;与光滑爪蟾、小鼠和人类的同源性较低分别为38%、42%和41%.RT-PCR分析表明,DMRT 1基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5、13、18、22和35 d的仔鱼均有表达,在孵化后22 d表达量最高.在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达,其他组织均无表达,表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成.     

耐碱细菌NTT36耐碱基因的克隆及表达产物的分析

耐碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６总ＤＮＡ经ＥｃｏＲＩ酶不完全消化，与质粒ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ酶切产物在体外重组后，转化大肠杆菌ＨＢ１０１．在碱性平板上直接筛选耐碱转化子，转化子经检测具有氨苄青霉素（Ａｍｐｒ）抗性，分析表明转化子具有１５ｋｂ大小的重组质粒．用此重组质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１、ＤＨ５α和ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，均产生大量同时具有耐碱性和Ａｍｐ抗性的转化子．通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和点杂交证明此重组质粒（定名为ｐＧＣＡ）由ｐＵＣ１８和ＮＴＴ３６总ＤＮＡ的片段组成．分别提取上述３种克隆转化子和ＮＴＴ３６细胞膜蛋白，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ梯度凝胶电泳，发现在ｐＨ１０．６条件下培养的转化子和供体菌ＮＴＴ３６与在中性培养基中生长的转化子和受体菌相比，有５条多肽带有明显差异．表明这５条多肽带与耐碱性有关．     

假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法根据GenBank上登录的假结核耶尔森菌侵袭素蛋白核酸序列设计引物,用PCR方法扩增假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因,并将其插入克隆载体pMD18-T中,测序鉴定正确后再将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-inv.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测.结果假结核耶尔森菌提取的基因组,经PCR扩增,得到一段591 bp的片段,与预期结果一致;SDS-PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约46 kDa,与预期结果相同;重组菌体超声裂解后,经12%的SDS-PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为包涵体蛋白.结论克隆的侵袭素基因核心片段可以在原核细胞中高效表达.     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP70基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列。用半定量PCR方法研究了HSP70mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况。结果表明:HSP70cDNA全长为2 664bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1 917     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列.用半定量PCR方法研究了HSP70 mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况.结果表明:HSP70cDNA全长为2664 bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1917 bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3 kD.HSP70基因不含内含子.氨基酸序列分析发现,推导的氨基酸序列含有HSP70家族的3个标签序列(I10 DLGTTYS17,V198 FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKV QK350).氨基酸序列同源性比较显示HSP70与紫贻贝(Mytihcs galloprovincialis)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)氨基酸序列同源性分别为79.47％和77％.半定量PCR分析显示在正常褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺5种组织中均能检测到HSP70的基因表达.经过热休克或病原菌刺激后,蚌各组织中HSP70 mRNA的表达显著增加,其中热休克处理后,蚌的鳃和血液中HSP70 mRNA表达量增加最为显著;而嗜水气单胞菌刺激后蚌的肌肉和鳃组织中HSP70 mRNA表达量增加最明显.     

猪瘟病毒石门株E2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了猪瘟病毒石门株的Ｅ２基因．扩增片段大小为１１８４ｂｐ，与预期大小一致．经ＳａｃＩ酶切和巢式ＰＣＲ证实了Ｅ２基因的特异性．将Ｅ２基因扩增片段首先克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，进行全序列测定，将该基因再克隆到表达载体ｐＢＶ２２１．采用温控诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示Ｅ２基因获得表达．ＥＬＩＳＡ表明Ｅ２基因表达产物可与猪瘟阳性血清起特异性反应．     

池蝶蚌金属硫蛋白基因的原核表达及活性分析

筛选池蝶蚌性腺转录组并运用RT-PCR方法扩增池蝶蚌金属硫蛋白(metallothionein,MT)ORF框序列。该序列有216个碱基组成,编码71个氨基酸,其中半胱氨酸含量丰富,富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys结构。多序列比对表明,池蝶蚌MT蛋白序列和其他物种MT序列有很高的同源性,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)MT蛋白具有100%的同源性。将该ORF框片段导入原核表达载体pET-32a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为27kDa,在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导4h表达量最高,重组蛋白主要存在上清液中,纯化并获得了重组蛋白。细胞增殖实验表明,纯化的MT融合蛋白有生物活性并能有效地减轻宫颈癌Hela细胞的氧化胁迫效应。