油松遗传多样性研究的ISSR—PCR体系优化与初步应用

以油松基因组DNA为模板,对影响ISSR-PCR的主要因素进行研究,建立了适宜于油松的ISSR-PCR优化体系及扩增程序;并采用lSSR标记对山西灵空山和陕西洛南2个油松种群的遗传多样性进行了分析,同时将此结果与使用RAPD标记的研究结果进行了对比.结果表明,在20μL反应体系中,模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物5种主要成分的最适浓度分别为40 ng、2.5 mmol·L-1、0.20 mmol·L-1、1 U和0.5 μmol·L-1.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30s,最适温度(54～56℃)退火45s,72℃延伸2min.共计35个循环;循环结束后72℃延伸7min,4℃保存.山西灵空山和陕西洛南2个油松种群的Nei's遗传多样性分别为0.3520和0.3514,前者的遗传多样性显著高于后者(P<0.001).使用ISSR标记与RAPD标记所获结果基本一致,但是lSSR标记优于RAPD标记.     

泽泻ISSR反应体系的建立与优化

以四川泽泻为实验试材,采用改进的CTAB法提取了泽泻的高质量总DNA模板,克服了泽泻中所富含的酚类物质的影响.对泽泻ISSR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选,建立了标记位点清晰、稳定、重复性好、可用于泽泻ISSR-PCR分析的最适反应体系,它们是:25μL PCR反应体系中,10×Taq酶配套缓冲液,1U Taq DNA聚合酶,1.8~2.0 mmol/L MgC l2,100μmol/L dNTP,0.3μmol/L引物,DNA模板约10~20 ng,退火温度在52~60℃;为进一步研究泽泻居群的ISSR分子标记鉴别奠定了基础.     

三角梅ISSR反应体系的建立和优化

对影响三角梅ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合三角梅的ISSR反应体系:PCR反应体积为20μL,其中10×buffer(含Mg2+)2.0μL,dNTP250μmol/L,Taq酶1.0U,引物0.3μmol/L,模板DNA20ng。扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,51.6℃退火1min,72℃延伸2min,34个循环;最后72℃延伸7min。该反应体系标记点位清晰、稳定、重复性好,适宜三角梅ISSR分析,为应用ISSR技术鉴定三角梅种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。     

适合于延龄草的ISSR体系的建立

以延龄草基因组DNA为模板,对ISSR反应体系中的一些重要参数进行了探索和优化实验,确立了适合延龄草的ISSR反应体系,即20μL反应体积中,模板DNA为20 ng、引物浓度为0.6μM、dNTP浓度为0.6 mM、Taq DNA聚合酶1 U.反应循环过程为：94℃变性30 s、52℃退火45 s、72℃延伸2 min、45个循环,72℃延伸7 min.该体系重复性和稳定性都较好,可有效地应用于延龄草遗传多样性的研究.     

阔叶十大功劳ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因子试验和正交设计方法,对影响阔叶十大功劳ISSR-PCR反应体系的引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA及退火温度5个因素进行优化,为探讨阔叶十大功劳种质遗传多样性奠定基础.结果表明:阔叶十大功劳ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20μL反应体系中,0.5μmol/L引物、0.5UTaq酶、150μmol/L dNTPs和20ng模板DNA.在最佳反应条件下,从80条引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并经过9份阔叶十大功劳种质检验,证明该体系具有扩增条带清晰、稳定、重复性好等优点.综上所述,本文所建立的ISSR-PCR反应体系可用于阔叶十大功劳的种质鉴定及遗传多样性分析.     

水溞RAPD反应体系的优化和建立

以大型溞、发头裸腹溞、蚤状溞和老年低额溞为研究材料,采用改变退火温度和循环次数等条件对RAPD扩增技术进行了优化研究.结果表明:在条件优化后(退火温度为42℃,循环次数为46次)有5条RAPD引物(A-04,A-07,B-12,C-11和C-20)在4个群体中均有扩增条带.由此表明,退火温度和循环次数的优化有利于水溞RAPD鉴定技术的建立.该研究将为水溞的遗传多样性分析奠定基础.     

爱玉ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子试验和正交设计,对影响爱玉ISSR-PCR扩增效果的因素,如模板DNA用量、Taq酶用量、dNTPs浓度、引物浓度、延伸时间和循环次数等指标进行优化.实验确立了可用于爱玉ISSR-PCR分析最适宜的反应体系：20 μL反应体积中含1 ng模板DNA、1.0 U Taq酶、0.4 μmol/L引物和0.18 mmol/L dNTPs;PCR扩增程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸2.5 min,共35个循环;72 ℃延伸7min,4 ℃保存.应用该体系对14份爱玉种质进行扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

罗汉果ISSR-PCR反应体系的建立

以罗汉果 ( Siraitia grosvenorii) DNA为材料 ,分析了模板 DNA,Mg2 + ,d NTPs,引物的浓度 ,Taq DNA聚合酶的用量以及循环次数对 ISSR-PCR扩增结果的影响 ,确立了稳定的、可重复的罗汉果 ISSR最佳反应体系和 PCR扩增参数 :在 2 5μL的 PCR反应体系中 ,含 2 0～ 5 0 ng模板 DNA,1 U Taq酶 ,1× PCR缓冲液 ,2 .0 mmol/L Mg Cl2 ,4种 d NTPs各 2 0 0 μmol/L,0 .5 μmol/L引物 ;PCR扩增程序为 94°C预变性 3 min,接着进行 40个循环 :94°C变性 1 min,5 2°C退火 5 0 s,72°C延伸 2 min,循环结束后 72°C延伸 7min.     

驱蚊草组织培养及其再生体系的建立与优化

通过对驱蚊草离体叶片和茎段的培养及植株再生的研究,成功地建立了驱蚊草组织培养快繁技术体系.用0.1%升汞对叶片、叶柄和茎段进行消毒,最佳消毒时间分别为6.5、6.0、7.0 m in;叶片和茎段不定芽诱导的最适培养基为M S BA(1.0 m g/L) NAA(1.0 m g/L),叶柄为M S BA(0.5 m g/L) NAA(0.5 m g/L);不定芽的最适增殖培养基为M S BA(0.75 m g/L) NAA(0.6 m g/L) GA3(0.2 m g/L),增殖倍数为6.1;最适生根培养基为1/2 M S培养基,生根率92%,平均每株生根数为10条.     

青藏高原东南部四川嵩草的遗传多样性研究

基于随机扩增多态DNA(RAPD)方法分析了青藏高原东南部四川嵩草(Kobresia setchwanensis)4个居群的遗传多样性.14条随机引物共扩增出180个位点数,其中多态性位点138个.结果表明,四川嵩草4个居群的遗传多样性大小与生境有相关性,而与海拔没有明显相关性(P=0.768>0.05,r=-0.232).AMOVA数据表明,四川嵩草的遗传变异主要分布在居群内(77.45%),居群间的遗传变异占总变异的22.55%,遗传分化指数GST也显示了相似的结果(0.2101),这一结果符合风媒异交的繁育系统.从四川嵩草4个居群的遗传距离和聚类分析,以及用NTSYS对四川嵩草4个居群的的遗传距离矩阵与地理距离矩阵间的关系进行Mantel检测,结果表明,各居群间的遗传距离与地理距离之间没有明显相关性(r=0.61211,P=0.9176>0.05).     

海桐ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对海桐的遗传多样性进行研究,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如退火温度、Mg2 浓度、4×dNTP浓度、牛血清白蛋白浓度、模板DNA用量、引物用量以及Taq DNA聚合酶用量等指标进行优化,建立了可用于海桐ISSR分析最适宜的反应体系:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,2.0 mg/mL牛血清白蛋白,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 U Taq DNA聚合酶.引物UBC807的最适退火温度为50.7℃.     

椭圆食粉螨ISSR-PCR反应体系正交优化试验设计

以椭圆食粉螨基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,建立椭圆食粉螨的ISSR最佳反应体系.优化得到的反应体系为:Mg2 浓度1.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U、dNTPs浓度0.2 μmol/L、引物浓度0.3 μmol/L、模版DNA量40 ng.反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,48℃、50℃、52 ℃(不同引物退火温度各异)复性1 min,72 ℃延伸1.5 min,35个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存.通过梯度退火试验,确定不同引物的最适退火温度.     

五条蚋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过正交试验及单因素试验对五条蝻S.quinquestriatum ISSR-PCR反应体系中的引物、DNA模板、dNTP、Mg2+、BSA、Taq DNA聚合酶浓度6个关键因素进行优化,建立五条蚋ISSR最适反应体系:20μl反应体系中引物1.0 μmol/L、DNA模板50.0 ng/μl、dNTP 0.15 mmol/L、Mg2+ 1.50 mmol/L、BSA 2.00 mg/ml、Taq DNA聚合酶0.155U/μl.通过对24条备选引物进行温度梯度筛选,获得8条能够稳定扩增且多态性较好的引物.为今后利用ISSR技术进行五条蚋种群遗传多样性研究奠定了良好的技术基础.     

红树植物海漆ISSR条件的优化

在利用ISSR分析对海漆Excoecaria agallocha的遗传多样性进行了研究.为获得清晰、重复性的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的多个因素,包括DNA的提取、模板浓度、TAQ酶的选择与用量、Mg2 和dNTP浓度等进行了比较、优化,确定了海漆ISSR-PCR分析最适宜的扩增条件:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris·HCl,pH 9.0,50mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),0.6～0.7 U Taq DNA聚合酶(上海申能博彩生物科技有限公司),0.2 μmol/L 引物,0.2 mmol/L dNTP,1.5～2.0 mmol/LMgCl2,10 ng模板DNA.     

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为:25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2+2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。     

正交设计优化芥菜ISSR反应体系研究

利用正交实验设计,对芥菜ISSR-PCR反应的5因素4个水平进行研究,建立了芥菜ISSR—PCR反应的最佳体系,即在20μL反应体系中,模板DNA40ng,引物10pmol,10&#215;反应缓冲液,dNTPs为0．5m mol／L,TaqDNA聚合酶1U,Mg^2＋ 2．0mmol／L．并进一步进行梯度退火实验,找到了芥菜ISSR最适的退火温度为51℃．