应用超滤液相色谱技术筛选中药抑制磷酸二酯酶4活性成分

本文应用超滤液相色谱技术,结合体外活性实验筛选了中药红花、土茯苓和防风中抑制磷酸二酯酶4活性成分。红花、土茯苓和防风提取物的IC50值分别为0. 03μg·μL-1,0. 06μg·μL-1和0. 05μg·μL-1,实验结果表明红花对磷酸二酯酶4具有强抑制作用,其次为防风、土茯苓。红花黄色素、落新妇苷和5-氧甲基维斯阿米苷的IC50值分别为41. 83μM,8. 11μM和3. 62μM,与磷酸二酯酶4有较好的结合能力,分别为红花、土茯苓和防风中主要抑制磷酸二酯酶-4活性成分。     

红土茯苓抑制5-LOX活性成分的筛选与分离

本实验以5-脂氧合酶为靶点,利用超滤液质联用技术筛选并鉴定红土茯苓中抑制5-脂氧合酶活性成分。结果表明,红土茯苓中白藜芦醇对5-脂氧合酶的抑制活性最强,其次为落新妇苷、黄杞苷、异黄杞苷和异落新妇苷。在此基础上首次采用高效逆流色谱技术,以正己烷∶正丁醇∶水(1∶2∶3∶v/v/v)为溶剂体系,从红土茯苓中分离得到落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷、异黄杞苷和白藜芦醇,经高效液相色谱分析,其纯度分别为98.39%,86.23%,97.15%,90.28%和99.29%。应用液-质联用技术,通过与标准化合物的保留时间、分子量,对分离得到五种化合物进行了结构鉴定。     

氧化石墨烯基质毛细管电色谱胰蛋白酶微反应器的性能研究

基于石墨烯优良的物化性能,利用层层组装法将氧化石墨烯修饰于石英毛细管内壁,制备了氧化石墨烯基质的毛细管电色谱,通过电渗流、拉曼光谱等对其进行表征。在此基础上,基于离子键合法将胰蛋白酶固定于毛细管电色谱柱头,制备胰蛋白酶微反应器。两者结合构成毛细管电色谱胰蛋白酶微反应器。实验结果显示,氧化石墨烯作为基质既可提高样品的分离效率,还能促进胰蛋白酶的催化性能。氧化石墨烯修饰的毛细管电色谱对N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)和N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)混合物的分离度从裸毛细管的3.70提升至4.71,而其固定化酶活性(米氏常数K_m=1.10 mmol/L,最大反应速率V_(max)=0.32 mmol·L~(-1)·s~(-1))也明显优于裸毛细管(K_m=109.77 mmol/L,V_(max)=0.000 46 mmol·L~(-1)·s~(-1))。利用所制备的微反应器从10种中药材中筛选胰蛋白酶抑制剂活性成分的药材,结果发现三七和大黄中均存在胰蛋白酶抑制剂活性成分。     

重组嗜热β-葡萄糖苷酶转化稀有人参皂苷Rd和CK

利用高效液相色谱(HPLC)法,对重组嗜热β-葡萄糖苷酶(Fpglu1)转化稀有人参皂苷(Rd和CK)进行研究,并表征了其催化动力学参数.利用同源模建和分子动力学模拟等生物信息学技术,探究了Fpglu1转化人参皂苷的结构基础及其相互作用.结果表明,Fpglu1能够水解人参总皂苷生成稀有皂苷Rd和CK,其催化人参皂苷Rb_1,Rb_2和Rc的K_m值分别为0.318,1.840和5.269 mmol/L;酶的转换数(k_(cat))值分别为144.191,0.572和0.011 s~(-1).当转化时间分别为6和102 h时,Rd和CK的产率达到最大,分别为60%和93%.通过对该酶的结构预测及皂苷分子的对接研究发现,底物位于由疏水性氨基酸构成的底物口袋中,氨基酸残基Glu194和Glu367是参与催化作用的关键,且实验测得的酶促反应动力学参数(K_m)与对接的相互作用能量值存在线性关系.     

HL-60细胞DNA甲基化酶的纯化和性质

通过将HL-60细胞移植到裸鼠体内获得实体肿瘤。以此为材料确立了一个简便的提纯DNA甲基化酶程序,它包括:细胞的超声破碎、超离心、去核酸、硫酸铵盐析、DEAE-纤维素柱层析及Sephadex G100凝胶过滤。用梯度-PAGE得到一条电泳均一的区带,测得该酶的分子量为479kD,该酶的最适pH为8.2,对钾、钠离子敏感,对热不稳定;用L-B作图法测得其对底物S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)的K_m为2.94×10~(-5)mol/L;SAH是该酶的竞争性抑制剂。在1mmol/L S-腺苷酰-L-高丰胱氨酸(SAH)存在下,其K_i为4.17×10~(-4)mol/L,同时也测定了该酶对DNA底物的专一性及几种代谢相关物对该酶的调节作用。     

20α-羟基孕酮对土拨鼠肾上腺微粒体甾体羟基化反应的抑制作用

本文研究了20α-羟基孕酮对土拨鼠肾上腺微粒体P-450催化甾体羟基化的抑制作用。探明了17α-羟基孕酮作底物时,20α-羟基孕酮对P-450_(C_(21))催化的C_(21)羟基化反应及P-450_(17αlyase)催化的C_(17)—C_(20)键断裂的反应均表现出拮抗抑制。抑制常数分别为1.73μmol/L(P-450_(C_(21)))和1.37μmol/L(P-450_(17lyase))。比较了分别以孕酮和17α-羟基孕酮作底物时,20α-羟基孕酮对P-450_(17αlyase)催化C_(17)—C_(20)键断裂的不同影响,由此推论出雄甾烷二酮在肾上腺微粒体中生成的连续反应机理。     

UPLC-MS/MS结合多探针底物方法研究刺五加叶中黄酮苷类成分对CYP450活性的影响

利用超高效液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)技术结合多探针底物方法, 研究了刺五加叶中的主要黄酮苷类化合物槲皮苷、金丝桃苷及芦丁对肝细胞色素P450酶(CYP450)亚型CYP1A2, CYP2C, CYP2E1, CYP2D和CYP3A活性的影响. 结果表明, 3种化合物对各CYP亚型酶均有抑制作用, 其中金丝桃苷和槲皮苷对CYP1A2催化的非那西丁的O-脱乙基反应抑制的IC₅₀值分别为46.53和49.75 μmol/L, 金丝桃苷和芦丁对CYP2E1催化的氯唑沙宗的6-羟基化反应抑制的IC₅₀值分别为99.87和86.36 μmol/L. 机理性抑制实验结果表明, 3种化合物对2种亚型酶的抑制作用是随着预孵时间延长而增强的机理性抑制.     

基于探针底物法的高效液相色谱-串联质谱法测定蚯蚓体内4种CYP同工酶活力及其应用北大核心CSCD

基于探针底物法,将蚯蚓微粒体悬浮液加入至含有混合探针底物香豆素(50μmol·L^(-1))、安非他酮(25μmol·L^(-1))、阿莫地喹(50μmol·L^(-1))、右美沙芬(5μmol·L^(-1))的孵育体系中(微粒体蛋白质量浓度需控制在32~96 mg·L^(-1)内),于37℃孵育20 min后,加入甲醇终止反应,静置10 min后过0.22μm滤膜,采用高效液相色谱-串联质谱法测定对应的代谢物7-羟基香豆素、羟基-安非他酮、N-脱乙基阿莫地喹、右啡烷的生成量。根据相应代谢物的生成量分别评价蚯蚓CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力。采用Acquity UPLC HSS T3柱作为分离柱,以不同体积比的含1 mmol·L^(-1)乙酸铵的0.05%(φ)甲酸溶液和甲醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱,串联质谱中采用电喷雾离子源正离子模式和多反应监测模式检测,并用基质匹配法配制混合标准溶液系列。结果显示:7-羟基香豆素、羟基-安非他酮、N-脱乙基阿莫地喹、右啡烷的质量浓度均在2.5~50μg·L^(-1)内与其对应的峰面积呈线性关系;对空白样品进行3个浓度水平的加标回收试验,回收率为73.7%~103%,日内相对标准偏差(RSDs,n=5)为2.1%~11%,日间RSDs(n=5)为4.6%~10%。方法用于分析分别暴露于多壁碳纳米管染毒土壤(暴露组)和普通土壤(对照组)21 d后蚯蚓体内4种CYP同工酶的活力,CYP2C8酶活力明显高于CYP2A6、CYP2B6及CYP2D6,暴露组中CYP2A6及CYP2C8酶活力显著(P<0.05)高于对照组,而CYP2B6及CYP2D6酶活力与对照组的无显著性差异,因此推测可将CYP2A6及CYP2C8作为一套生物标记物,用于定性诊断土壤的多壁碳纳米管污染。     

新型免疫抑制剂落新妇苷C-5位糖苷衍生物的合成研究

落新妇苷具有选择性免疫抑制活性,基于前药原理在落新妇苷母核上引入D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖和D-阿拉伯糖四种天然单糖,以增加其水溶性,提高生物利用度。首先以落新妇苷为起始原料,4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化乙酰化反应制备C-5位羟基中间体(TR-B1),其次三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)催化三氯乙酰亚胺酸酯糖基供体与TR-B1进行糖苷化反应,甲醇钠脱保护基制备目标化合物TR-B3-GA、TR-B3-GL、TR-B3-MA和TR-B3-Ab。溶解性实验表明目标化合物极性显著增强,水溶性从原料(AB)的微溶提高到极易溶解。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定血清中叶酸代谢物

建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)定量检测人体内叶酸6种主要代谢产物的方法。采用BEH C18色谱柱(2.1×50 mm,1.7μm),以甲酸-乙腈为流动相,流速为0.4 m L/min,进样体积5μL,梯度洗脱法进行分离,电喷雾正离子模式下以多反应检测(MRM)方式检测,外标法定量。6种叶酸代谢产物检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分别为0.05~0.20 ng/m L和0.15~0.50 ng/m L,6种代谢产物(叶酸、5-甲基四氢叶酸(5-Me THF)、5-甲酰四氢叶酸(5-Fo THF)、同型半胱氨酸(Hcy)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷高半胱氨酸(SAH))分别在一定范围内呈线性相关,相关系数R2≥0.998;在血清样品中加标回收率为90.1%~105.3%,日内和日间RSD均小于6%。     

邻苯二甲酸酐化学修饰对辣根过氧化物酶催化活性的影响

通过采用邻苯二甲酸酐(PA)对辣根过氧化物酶(HRP)的蛋白链进行修饰, 研究了PA化学修饰对HRP的稳定性、催化活性、活性中心结构、酶对底物的亲合性和专一性等催化性质的影响. 结果显示: 酸性条件下(pH=3), 4小时后PA-HRP的催化活性比天然HRP提高了7.5%;碱性条件下(pH=10), 4小时后PA-HRP的催化活性比天然HRP提高了27%. PA-HRP的K_m值为8.16 (mmol/L), 小于天然HRP的K_m值12.99 (mmol/L), 而PA-HRP的k_(cat)/K_m值为7.86(10~4(L/ mmol· min)大于天然HRP的k_(cat)/K_m的6.70(10~4(L/ mmol· min). 这些催化活性和动力学数据表明了PA-HRP与天然HRP相比其稳定性、酶对底物的亲和性和专一性得到了提高. 紫外-可见光谱、拉曼光谱数据显示: 修饰剂PA 改变了天然HRP血红素周围的微环境, 对酶蛋白分子的活性中心结构并没有影响. 差示光谱显示PA修饰剂可以提高酶对底物的亲和力.     

氨基酰化酶在脲溶液中变性时构象变化速度与失活速度的比较

应用了邹氏不可逆抑制动力学的方法,在变性剂存在的条件下,连续监测酶催化的底物反应过程,测定了氨基酰化酶在不同浓度脲溶液中失活的速度常数,并考察了底物的存在对酶失活的保护作用。同时,还比较了氨基酰化酶在不同浓度脲溶液中变性时失活和构象变化的速度。1mol/L,2mol/L脲变性时失活速度常数为为1.62×10~(-2)S~(-1)和2.05×10~(-2)S~(-1),但是酶分子的整体构象尚未发生明显变化。3mol/L脲变性时,失活速度常数为2.56×10~(-2)S~(-1),而变性速度常数为3.72×10~(-3)S~(-1)。失活速度比构象变化速度快大约一个数量级。在4mol/L,5mol/L,6mol/L脲溶液中变性时,酶分子快速失活,而其构象变化速度常数分别为5.27×10~(-3)S~(-1)。5.47×10~(-3)S~(-1),5.56×10~(-3)S~(-1)。可见,在相同浓度的脲溶液中,氨基酰化酶的失活速度明显快于酶分子整体构象变化的速度。上述结果表明,含有辅基金属离子Zn~(2+)的氨基酰化酶的活性部位较酶分子的整体结构也具有一定的柔性。     

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定黄芩提取物中4种黄酮类成分

黄芩提取物样品中加入水,经甲醇超声提取2次,离心后,合并上清液,用水定容至50.0mL,过0.22μm微孔滤膜,采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定滤液中黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷等4种黄酮类成分的含量。以ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱为固定相,以不同体积比的0.01%(质量分数)氨水和乙腈的混合液为流动相进行梯度洗脱,串联质谱分析中采用电喷雾离子源负离子模式(ESI-)和多反应监测模式。4种黄酮类成分的质量浓度在5.0～500.0μg·L~(-1)内与其对应的质谱响应值呈线性关系,检出限(3S/N)为0.3～1.5μg·kg~(-1),测定下限(10S/N)为1.0～5.0μg·kg~(-1)。以空白黄芩提取物样品为基体进行加标回收试验,所得回收率为91.1%～99.1%,测定值的相对标准偏差(n=6)为2.0%～4.1%。     

刺五加叶黄酮脂质体和滴丸的药动学差异比较

采用液质联用(LC-MS/MS)方法,分析刺五加叶黄酮脂质体、刺五加叶滴丸和刺五加叶黄酮提取物经大鼠灌胃给药后其主要成分金丝桃苷的药代动力学和生物利用度,考察刺五加叶黄酮的适宜剂型。用PKsolver软件进行药代动力学数据处理,大鼠灌胃刺五加叶黄酮提取物、刺五加叶滴丸和刺五加叶黄酮脂质体后测得金丝桃苷的最大血药浓度(C_(max))分别为(210.24±10.3)、(254.12±9.2)、(349.34±12.5)μg/L;0~t时间内药时曲线面积(AUC_(0-t))分别为(30.7±2.7)、(35.01±1.98)、(45.2±2.8)μg/(m L·min);平均驻留时间(MRT)分别为(334.42±75.36)、(394.56±90.26)和(640.35±84.26)min。结果表明,刺五加叶黄酮脂质体血药达峰浓度增加,清除速率降低,药时曲线下面积加大,生物利用度显著提高,脂质体有望成为刺五加叶黄酮的适宜剂型。     

反相流动注射化学发光法测定黄芩苷

在碱性介质中,K3Fe(CN)6氧化鲁米诺产生化学发光,黄芩苷对该体系化学发光具有强烈的抑制作用。利用该化学发光的抑制体系,结合反相流动注射技术,建立了测定黄酮类药物黄芩苷含量的新方法。在优化的条件下,黄芩苷浓度在1.0×10-8～1.0×10-7和3.0×10-7～4.0×10-6mol/L范围内与化学发光抑制强度ΔI呈良好的线性关系,检出限为1.0×10-9mol/L,对3.0×10-7mol/L的黄芩苷进行平行测定10次,得相对标准偏差(RSD)为1.7%。该方法可应用于银黄口服液中黄芩提取物(黄芩苷计)的含量测定。     

滤膜冷凝收集-离子色谱法测定固液气溶胶中5种水溶性阴离子北大核心CSCD

水溶性离子是固、液气溶胶的重要组成部分,对于气溶胶的理化性质和空气质量具有重大影响,研究水溶性离子的含量对于大气环境的污染与防治具有深远意义。该研究建立了一种滤膜冷凝收集-离子色谱技术采集固体气溶胶和液体气溶胶并测定其中的5种水溶性阴离子(Cl^(-)、F^(-)、NO^(-)_(3)、NO2^(-)、SO4^(2-))含量的方法。首先,采用固体颗粒过滤器和冷凝收集法分别收集固体气溶胶和液体气溶胶,固体气溶胶以固体颗粒物的形式被收集在固体颗粒过滤器内,液体气溶胶以冷凝液的形式在冷阱中被收集。其次,以离子色谱法对固、液体气溶胶中的水溶性阴离子含量进行检测。在以Dionex IonPac AS11-HC-4μm作为分析柱,流速为1 mL/min,柱温为30℃,淋洗液氢氧化钾(KOH)浓度在0~40 min内由1 mol/L线性增至25 mol/L,进样量100μL的条件下,各离子在40 min内有效分离,5种阴离子在0.1~10 mg/L范围内线性关系良好(相关系数为0.9992~0.9997),检出限低(0.02~0.04 mg/L)。对样品采集条件(采样时间、采样温度和采样流量)进行了优化,结果表明,在采样时间2 h、采样温度-13℃、采样流量1.0 L/min的条件下,可获得较为满意的结果。在优化的条件下分别对实际样品的两类溶胶中的5种阴离子含量进行了检测,测得实际样品的液体气溶胶中5种阴离子含量分别为5.7402μg/m^(3)(F^(-))、1.1599μg/m^(3)(Cl^(-))、3.3233μg/m^(3)(NO^(-)_(2))、2.4861μg/m^(3)(NO^(-)_(3))和0.9745μg/m^(3)(SO^(2-)_(4)),固体气溶胶中5种阴离子含量分别为14.1037μg/m^(3)(F^(-))、5.0398μg/m^(3)(Cl^(-))、9.3052μg/m^(3)(NO^(-)_(2))、8.4528μg/m^(3)(NO^(-)_(3))和5.6314μg/m^(3)(SO^(2-)_(4))。该方法可应用于实际的大气检测中,也为其他离子的采集和分析条件的摸索提供了方法。     

吡啰红B为指示剂细胞色素C催化荧光测定青蒿素

在细胞色素C催化下,吡啰红B与青蒿素反应导致荧光降低,细胞色素C与青蒿素的反应为酶-底物模型。动力学研究表明,稳态催化速率依赖于酶和底物浓度,催化常数Km、Vm ax及Kcat分别为3.3×10-5mol/L,5.4×10-6mol.L-1.s-1和13.5 s-1,催化活性受去活化剂和乙醇抑制。在pH 5.3、25℃及7.6×10-7mol/L的细胞色素C催化条件下,荧光降低值ΔF(F0-F)与青蒿素浓度在7.1×10-8~1.1×10-6mol/L范围内呈线性关系;检出限为7.2×10-9mol/L;加标回收率为96.3%~106.8%。方法已用于测定血浆和尿液介质中的微量青蒿素。     

N,O-羧甲基壳聚糖修饰对L-天门冬酰胺酶血浆半衰期及其他性质影响

将具有抗癌作用的L-天门冬酰胺酶用N,O-羧甲基壳聚糖进行化学修饰,以降低酶的抗原性,提高其在体内的半衰期.实验结果表明,修饰酶的表观K_m值与自由酶相差不多,分别为2.6×10~(-4)mol/L和2.2×10~(-4)mol/L(20℃),而抗胰蛋白酶和糜蛋白酶水解能力有很大提高.酶经修饰后抗原性大大降低,且修饰剂分子量越高,降低抗原性的效果越好.自由酶在兔体内的半衰期为1.2h,而修饰酶为40h,提高了33倍.     

葛根中抑制磷酸二酯酶4活性成分的筛选研究

实验选取与抗炎免疫密切相关的磷酸二酯酶4为靶点,应用超滤液质联用技术和酶体外活性抑制实验筛选并鉴定了葛根中抑制磷酸二酯酶4活性成分.实验结果表明葛根提取物具有抑制磷酸二酯酶4的作用,IC50值为0.04g/L.葛根素抑制磷酸二酯酶4作用最强,其次为大豆苷和大豆苷元,IC50值分别为52.79,71.54和122.17μmol/L.超滤液质联用实验筛选结果与体外活性实验一致.3′-羟基葛根素和3′-甲氧基葛根素在2个实验中均没有抑制磷酸二酯酶4的作用.     

罗布麻叶黄酮类成分酶解前后的液相色谱-质谱分析及活性比较

采用高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESIMS)联用技术,对罗布麻叶中的黄酮类化合物及酶解产物进行了系统的研究。结果表明,罗布麻叶所含黄酮成分极性较大,包含白麻苷、芦丁、山萘酚-3-O-β-D-芸香糖苷、异槲皮素、扁蓄苷和乙酰化金丝桃苷。罗布麻叶黄酮类成分经过β-葡萄糖苷酶和α-鼠李糖苷酶混合酶液酶解后发生水解,水解产物包括金丝桃苷、异槲皮素、乙酰化金丝桃苷、三叶豆苷、紫云英苷、槲皮素和山萘酚。将酶解前后各化合物的高效液相色谱峰面积进行比对,证明白麻苷、山萘酚-3-O-芸香糖苷和扁蓄苷为酶解前罗布麻叶主要成分,金丝桃苷、异槲皮素、扁蓄苷、槲皮素和山萘酚为酶解后的主要成分。细胞实验结果表明,酶解后3个剂量组的细胞相对增殖率较酶解前分别提升了14.61%、22.48%和20.22%。因此,通过β-葡萄糖苷酶和α-鼠李糖苷酶混合酶液酶解可以有效地将罗布麻叶黄酮苷转化为对应的黄酮苷元及疏水性的黄酮苷,大大提高了罗布麻叶黄酮提取物的抗抑郁活性。