基于聚多巴胺磁性纳米微球的洛美沙星适配体筛选研究

基于纳米材料与单链核苷酸可能存在的氢键作用、π-π结合、电荷转移等非共价结合方式,可快速区分对目标靶分子有特异性结合的单链核酸适配体候选分子,从而缩短适配体筛选周期、提高筛选的成功率.本研究采用聚多巴胺磁性纳米微球(MNPs@PDAs)为分离载体,以洛美沙星(LMX)为靶标分子,利用磁分离技术建立了一种小分子的适配体筛选新方法.经过7轮筛选,获得了对洛美沙星分子具有高亲和性(KD=(17.57±0.5)nmol/L)的核酸适配体AF-3,且AF-3对于结构相似分子培氟沙星(PEFX)、氧氟沙星(OFLX)、诺氟沙星(NFLX)不具有亲和性.基于MNPs@PDAs的筛选方法有望于应用于其它重要靶分子的高效适配体探针获取.     

毛细管电泳法高效筛选8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的核酸适配体

8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(OGG1)是人体中重要的功能蛋白,在修复DNA氧化性损伤过程中起关键作用。氧化应激等引起的氧化损伤易导致炎症反应的发生,对OGG1的抑制可以一定程度上起到缓解作用;对癌细胞OGG1的抑制有望作为癌症治疗的新方法。目前的研究多集中于小分子对OGG1功能的影响和调控,而OGG1的适配体筛选尚未见报道。作为功能配体,适配体具有合成简单、高亲和力及高特异性等优点。该文筛选了OGG1的核酸适配体,结合毛细管电泳高效快速的优点建立了两种基于毛细管电泳-指数富集进化(CE-SELEX)技术的筛选方法:同步竞争法和多轮筛选法。同步竞争法利用单链结合蛋白(SSB)与核酸库中单链核酸的强结合能力,与目标蛋白OGG1组成竞争体系,并通过增加SSB浓度来增加竞争筛选压力,以去除与OGG1弱结合的核酸序列,一步筛选即可获得与OGG1强结合的核酸序列。多轮筛选法在相同孵育条件和电泳条件下,经3轮筛选获得OGG1的核酸适配体。比较两种筛选方法的筛选结果,筛选结果中频次最高的3条候选核酸适配体序列一致,其解离常数(K_D)值在1.71~2.64 μmol/L之间。分子对接分析结果表明候选适配体1(Apt 1)可能与OGG1中具有修复氧化性损伤功能的活性口袋结合。通过对两种筛选方法的对比,证明同步竞争法更加快速高效,对其他蛋白核酸适配体筛选方法的选择具有一定的指导意义。得到的适配体有望用于OGG1功能调控,以抑制其修复功能。     

毛细管电泳法研究核酸库容量对蛋白质适配体筛选的影响

毛细管电泳(CE)具有高分辨、快速分离、样品用量小和无需固相介质等优点,是高效筛选核酸适配体的方法之一。然而,由于CE的进样量少,有限的核酸库容量是否影响毛细管电泳-指数富集配体系统进化(CE-SELEX)适配体的筛选效率,尚不明确。本研究以神经元特异性烯醇化酶(NSE)为模式蛋白,考察了CE筛选中核酸库容量对筛选效率的影响,以明确CE-SELEX方法的有效性。分别使用4个浓度(0.1、1、10和100μmol/L)的初始核酸库进行适配体筛选,比较了初始库与经3轮筛选后的次级核酸库的亲和力。结果表明,4个核酸库筛选轮次间库亲和力相近,且经2轮筛选后均得到了微摩尔级别的核酸适配体。此外,用高浓度核酸库筛选获得的序列更具多样性,但未能提升候选序列亲和力。经2轮筛选得到NSE的核酸适配体Seq qN-01,其与NSE复合物的解离常数(K_D)为(4.72±0.15)μmol/L,并表现出很好的特异性。综上,核酸库容量会提高后续富集库的序列多样性,但对适配体筛选效率没有显著影响。     

胃腺癌核酸适配体的筛选与特异性研究

核酸适配体可作为分子探针应用于胃腺癌的早期诊断和治疗,具有广泛应用前景。本实验利用Serum-SELEX（Ser-SELEX）技术筛选胃腺癌核酸适配体。通过对候选适配体二级结构分析,其二级结构多为茎环结构。圆二色谱分析显示,7条候选核酸适配体呈右手螺旋特征。通过荧光定量核酸扩增检测系统（q-PCR）检测了候选核酸适配体对胃腺癌靶标的亲和力,表明候选核酸适配体浓度梯度与Ct值均呈正相关,亲和力常数为纳摩尔级别。利用q-PCR法、量子点法验证了候选核酸适配体识别靶标的特异性,结果均显示Apt-101对靶标亲和力更高,特异性更强,Apt-101的平衡解离常数（K_d值）为6.444±1.128nmol/L,特异性检测阳性率大于70%。     

毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用

核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的高亲和性与特异性的寡核苷酸序列配体。毛细管电泳是高效、快速、低成本的微量分离分析技术。应用毛细管电泳高效、快速筛选核酸适配体是近几年出现的新方法。本文介绍了核酸适配体筛选过程中的主要分离方法如亲和色谱、醋酸纤维素膜、凝胶电泳和磁性分离等方法,并对近年来毛细管电泳在核酸适配体中的亲和作用研究以及用于核酸适配体筛选(CE-SELEX)的主要方法(ECEEM,NECEEM,Non-SELEX和三者比较)和研究进展进行了综述。     

蛋白质的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体是通过指数富集系统配体进化(SELEX)筛选获得的,与靶标具有高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA。蛋白质是生命进程中的关键功能分子。近年来,以蛋白质为靶标的适配体筛选在蛋白质相关的基础及应用研究领域受到广泛关注。核酸适配体应用性能的优劣取决于其亲和力、特异性与稳定性。目前,适配体筛选方法的优化主要是提高筛选效率、提升适配体性能及降低筛选成本。适配体主要筛选步骤包括复合物分离、核酸库优化、次级库的富集、适配体序列分析以及亲和力表征等。迄今为止,以蛋白质-核酸复合物的分离为核心步骤的适配体筛选方法有20余种。本文归纳总结了2005年以来以蛋白质为靶标的适配体筛选技术,讨论了各方法的缺陷与局限。介绍了核酸库的设计优化方法、适配体的序列特征,以及常用的亲和力表征方法。     

毛细管电泳法筛选脱铁转铁蛋白的核酸适配体及筛选影响因素分析

核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术,在体外筛选获得的与目标分子有高亲和力与特异性的寡核苷酸序列。由于筛选过程周期长且影响因素复杂,使用常规筛选方法进行多因素影响的条件优化的工作量大,样品消耗多,目前还少有系统的研究报道。毛细管电泳(CE)具有高分辨率、快速分离、样品用量小、筛选成本低的优势,是核酸适配体筛选的有效方法。本研究以人血清中脱铁转铁蛋白(A-TF)为模式蛋白,利用CE方法研究核酸库长度、孵育温度、缓冲溶液的种类与pH值、金属离子等因素对靶蛋白与核酸库相互作用的影响。结果表明,较短序列的核酸库与靶蛋白的亲和力更高;孵育温度、缓冲液种类与pH值均影响靶蛋白与核酸复合物的形成;低浓度的K⁺、Ca²⁺与Mg²⁺可促进复合物形成。基于优化的筛选条件,经过3轮毛细管电泳法筛选,获得了A-TF的适配体Seq A3,采用CE-LIF测得复合物的亲和常数K_D=0.476μmol/L。此适配体可用于人血清基质中A-TF的识别。     

蛋白质的核酸适配体筛选及应用的研究进展

核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)筛选方法获得的,能够与靶标分子高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA。蛋白质是一种非常重要的生物功能大分子,迄今为止,已经开发了许多SELEX技术,用于蛋白质的适配体的筛选。目前,适配体的筛选优化方法主要集中在提高筛选效率、降低筛选成本,以及提升适配体性能等方面,从而获得可与靶标分子以高亲和力和高特异性结合的适配体。适配体与靶标分子亲和力的表征是关键的筛选步骤,用于判定所筛选的适配体是否可以满足后续应用需求。本文归纳总结了2016年以来蛋白质靶标的适配体筛选的研究进展,对核酸适配体筛选过程中有关核酸库的优化方法和筛选方法的改进、新筛选方法的开发、核酸适配体的应用等方面的研究进行了评述。     

核酸适配体荧光探针在生化分析和生物成像中的研究进展

核酸适配体是指通过体外筛选技术从核酸文库中筛选出来,能够高特异性、高亲和力识别靶标物的寡核苷酸序列,具有靶标类型广泛、合成简单、相对分子质量小、化学稳定性高、易于进行生物化学修饰等优点。 核酸适配体能够通过折叠成特定的二维或三维构型与靶标物特异性结合,加上合适的信号转导机制,为重要靶标物的研究提供理想的分子识别与分子检测探针。 荧光检测技术具有高灵敏、高分辨率、易于实现多元分析等优点。 将核酸适配体的分子识别特性与荧光优异的光学检测性能相结合,在生命科学研究领域有着广泛的应用空间。 本文主要综述了核酸适配体荧光探针常见的分子设计和信号响应方式,及其在细胞成像、亚细胞成像中的应用研究,并对核酸适配体探针目前面临的一些挑战进行了讨论,最后对其未来的发展方向进行了展望。     

特异性检测珍珠龙胆石斑鱼虹彩病毒病的核酸适配体的筛选与鉴定

石斑鱼虹彩病毒是一种核质DNA病毒,不仅给海水养殖造成巨大的经济损失,而且严重威胁全球生物多样性。为了进一步阐明石斑鱼虹彩病毒侵染致病的分子机理,同时为石斑鱼虹彩病毒病的预防、诊断和治疗提供新的理论依据,本研究以珍珠龙胆石斑鱼虹彩病毒(SGIV-Gx)感染的宿主细胞为靶标,采用指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选获得4条核酸适配体(LYGV1、 LYGV2、 LYGV3、 LYGV4),并对核酸适配体的性质进行了系统的分析研究。各条核酸适配体识别SGIV-Gx病毒感染的宿主细胞具有高特异性和高亲和性,筛选的核酸适配体无毒副作用,而且核酸适配体LYGV3具有一定的抗病毒效果。对核酸适配体的靶标性质进行了分析,结果表明,核酸适配体(LYGV1、 LYGV2、 LYGV3、 LYGV4)的靶标可能是细胞膜蛋白或膜蛋白相关成分。其中,核酸适配体LYGV1的靶位点在SGIV-Gx病毒感染细胞2 h后出现在宿主细胞表面,核酸适配体LYGV2、LYGV3和LYGV4的靶位点的出现时间分别为病毒感染细胞后的4、8和6 h。     

核酸适配体在微流控芯片中筛选及病毒性疾病中应用

核酸适配体是短的、单链DNA或RNA序列。相较于抗体成本高、不稳定、免疫原性、难修饰的问题,核酸适配体作为新一代亲和试剂,有着免疫原性低、易修饰、靶标范围广等优势。通过指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)可获得与靶标分子特异性结合的核酸适配体,而如何提高核酸适配体筛选效率是核酸适配体广泛应用的一个瓶颈问题。目前,提高核酸适配体筛选效率的方法种类较多,而微流控SELEX的发展,加速了核酸适配体的发现。核酸适配体作为各种靶标的识别分子,具有诊断和治疗特定疾病的潜力。鉴于此,本文重点介绍核酸适配体在微流控芯片领域进行筛选的研究进展,以及阐述其在病毒性疾病中的应用以及展望。     

全细胞的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体(aptamer)是从人工合成的随机单链DNA(ssDNA)或RNA文库中筛选得到的,能够高亲和力、高特异性地与靶标结合的ssDNA或RNA。核酸适配体的靶标范围广,可包括小分子、蛋白质、细胞、微生物等多种靶标。其中以细胞为靶标的适配体在生物感应、分子成像、医学诊断、药物传输和疾病治疗等领域有很大的应用潜能。但全细胞的核酸适配体筛选过程复杂,筛选难度大,筛选的适配体性能不佳是导致目前可用的适配体非常有限的主要原因。由于细胞表面蛋白质在提取纯化过程中分子结构和形态会发生改变,故以膜表面蛋白质为靶标筛选的适配体很难应用于识别整体细胞。以全细胞为靶标的核酸适配体筛选则不需要准确了解细胞表面的分子结构,筛选过程中可保持细胞的天然状态,以全细胞为靶标筛选出的核酸适配体有望直接用于全细胞识别。本文总结了2008~2015年全细胞的核酸适配体筛选的研究进展,介绍了靶细胞的分类、核酸库的设计、筛选条件和方法以及核酸适配体的亲和力表征方法等。并列出全细胞靶标的核酸适配体序列。     

适配体探针传感技术进展

适配体是通过指数富集配基的系统进化技术体外筛选得到的一组能与靶分子高亲和、高特异性结合的寡核苷酸序列（单链DNA或RNA）。作为一类新型的功能分子,适配体己在生命科学、化学等领域获得愈来愈多的应用。以不同类型的示踪分子标记适配体后,该类适配体探针可以直观地将适配体与靶分子的特异性识别转化为灵敏的示踪信号,从而为金属离子、有机小分子、核酸和蛋白质等大分子乃至细胞等的检测提供一种灵敏、特异的新型模式。本文阐述适配体探针在多种传感技术方面中的应用,并着重介绍适配体探针荧光传感技术的最新发展。     

小分子靶标的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选得到的核糖核酸(RNA)或单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。核酸适配体通过高亲和力特异性地识别小分子、蛋白质、细胞、微生物等多种靶标,在生物、医药、食品和环境检测等领域的应用日渐增多。但目前实际可用的核酸适配体有限,其筛选过程复杂,筛选难度大,制约了其应用。与生物大分子、细胞和微生物等靶标不同,小分子靶标与核酸分子的结合位点少、亲和力弱,且靶标通常需要固定在载体上。此外,小分子靶标结合核酸形成的复合物与核酸自身的大小、质量、电荷性质等方面差异较小,二者的分离难度大。故小分子靶标的核酸适配体筛选过程与大分子和细胞等复合靶标相比有明显差异,筛选难度更大。因此需要根据其自身结构特点和核酸适配体的应用目的选定靶标或核酸库的固定方法,优化靶标核酸复合物的分离方法。本文介绍了不同类型小分子(具有基团差异的单分子、含相同基团分子和手性分子等)靶标的选择及其核酸适配体的筛选方法,并对核酸库的设计、与靶标结合的核酸的分离方法和亲和作用表征方法进行了介绍,列出了自2008年以来报道的40余种小分子靶标的核酸适配体序列和复合物的平衡解离常数(K_d)。     

毛细管电泳法筛选人IgG的Fc片段核酸适配体

基于毛细管电泳-指数富集配体系统进化技术(CE-SELEX)建立了免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段的核酸适配体筛选方法。通过毛细管区带电泳方法分析IgG完整蛋白、Fc与Fab片段的样品的纯度、荷电性质及是否吸附的特征,并比较三者与核酸库的亲和力。结果表明, IgG与核酸库形成明显的复合物,而Fc和Fab片段与核酸库的亲和力很弱。在筛选Fc片段的适配体时,选择Fab片段作为反筛靶,对去除非特异性结合序列无显著作用。设计了针对Fc片段的适配体筛选方案,在优化的孵育条件(10 mmol/L Na₂HPO₄-KH₂PO₄(pH 7.17), 0.05 mmol/L Mg²⁺, 37℃孵育25 min)下,经3轮筛选获得Fc片段的核酸适配体Seq Fc1～3,K_D值为0.071～0.321μmol/L,经胶体金比色分析方法验证了其亲和力与特异性。     

细菌的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选的能够以高亲和力和高特异性识别靶标分子或细胞的核糖核酸(RNA)和单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。作为化学抗体,核酸适配体的制备和合成比抗体的成本更低。核酸适配体的靶标范围极其广泛,包括小分子、生物大分子、细菌和细胞等。针对细菌靶标筛选的适配体,目前主要应用于食品、医药和环境中的细菌检测。细菌的核酸适配体筛选可以通过离心法将菌体-适配体复合物与游离的适配体分离,并通过荧光成像、荧光光谱分析、流式细胞仪分选、DNA捕获元件、酶联适配体分析等方法表征适配体与靶标的相互作用。筛选出的适配体可结合生物、化学检测方法用于细菌检测。本文介绍了细菌适配体的筛选和表征方法以及基于适配体的检测方法的最新进展,分析了不同检测方法的利弊,并列出了2011~2015年筛选的细菌的核酸适配体。     

基于Cell-SELEX的核酸适配体在生化分析与生物成像中的应用

基于Cell-SELEX的核酸适配体是指以活细胞为靶标物,通过指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的单链寡核苷酸.它能够与靶标细胞高亲和性、高特异性结合,具有分子量低、合成简单、化学稳定性好、免疫原性低、易于功能化修饰等优点,已广泛应用于生命科学研究领域.本文综述了基于Cell-SELEX技术筛选的核酸适配体在肿瘤细胞检测、分析和成像方面的研究进展,并对核酸适配体研究的发展前景和趋势进行了展望.     

哈维氏弧菌与溶藻弧菌共有核酸适配体的筛选及鉴定

共有位点是指不同微生物上结构相同或相似的位点,有些共有位点是同种或同属微生物所共有的,可以作为微生物种属鉴定的标记位点。因此,筛选这些共有位点的共有核酸适配体,不仅有助于对这些微生物进行总量分析,对于相关微生物的种属鉴定也具有重要意义。本研究以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为靶目标,筛选这两种弧菌共有位点的共有核酸适配体。经过8轮筛选,适配体富集库的亲和力提高了24.1倍,同源性分析表明,适配体富集库呈明显的收敛性,表现了较好的筛选效率。对2个核酸适配体C14和C22的亲和性和特异性进行了研究,结果表明,这两个核酸适配体对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好的亲和性和特异性,但对哈维氏弧菌的亲和力要显著高于溶藻弧菌,而对非弧菌属的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的亲和力较弱。C14对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和常数(K_d)分别为55.76和82.88 nmol/L, C22对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和常数分别为33.97和43.9...     

毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究

毛细管电泳(CE)被认为是核酸适配体筛选的高效方法,其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离高效,样品用量少,筛选成本低。但由于小分子靶与核酸的结合位点少,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,通常认为CE-SELEX不适用于筛选小分子靶标的适配体。本研究建立了基于CESELEX的盐酸克伦特罗靶标的的适配体筛选方法。将80 nt的ssDNA库与盐酸克伦特罗特混合孵育,通过CZE-UV分离混合物。收集ssDNA库峰前的馏分,通过PCR扩增和ssDNA制备,完成第一轮筛选。将次级核酸库经过3轮筛选,获得10条ssDNA序列。选择3条亲和力较强的序列Apt 4、Apt 7、Apt 12,通过CE-LIF测定其与盐酸克伦特罗的K_d分别为9.315×10~(-7)mol/L、1.040×10~(-6)mol/L和1.143×10~(-5)mol/L。软件分析表明,上述3条序列均可形成茎环二级结构,其中Apt 4茎环结构的自由能最低,结构最稳定。以沙丁胺醇为对照,验证了3条序列,具有较高的特异性。     

引言

核酸适配体特指具有分子识别功能的短序列的单链核酸,也被称为"化学抗体"。它既有可与抗体相当的亲和力和特异性,又有明显优于抗体的特点:可通过化学合成制备,无需动物免疫,成本低;分子性质稳定,能可逆变性与复性,易储存运输;分子量小,易穿过细胞膜,免疫原性低,无明显的毒副作用;靶标范围广泛,包括金属离子、小分子、蛋白质、细胞和微生物等。Web of Science数据库显示,仅2010年以来就有超过5300篇核酸适配体论文发表,涉及生物医学、分子生物学、化学生物学、分析化学、材料化学、物理学、数学等学科领域。核酸适配体研究具有交叉学科特色,与核酸适配体应用相关的食品、环境和生物分析检测,以及核酸适配体在疾病诊断和治疗、药物研发和分子成像领域的应用潜力正吸引多学科领域研究者的广泛关注。我国学者在核酸适配体研究领域取得大量处于世界前列的研究成果。2009年以来,约300个核酸适配体相关项目获国家重大研究计划以及国家自然科学基金资助。近3年来,在生物、医学、中医药、环境和食品安全检测领域的核酸适配体相关应用研究也在快速增加。 纵观核酸适配体25年的发展,已报道的靶标超过500种,筛选出的核酸适配体超过2300种。但大量的研究和应用主要集中于一些常见的靶标和特定的核酸适配体。令人满意的具有实际应用价值的核酸适配体数目还非常有限。研究者普遍的共识是,核酸适配体的筛选过程复杂,筛选效率低,且缺少标准化的方法表征适配体的功能,这是目前制约核酸适配体广泛应用的两个瓶颈。