毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用

核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的高亲和性与特异性的寡核苷酸序列配体。毛细管电泳是高效、快速、低成本的微量分离分析技术。应用毛细管电泳高效、快速筛选核酸适配体是近几年出现的新方法。本文介绍了核酸适配体筛选过程中的主要分离方法如亲和色谱、醋酸纤维素膜、凝胶电泳和磁性分离等方法,并对近年来毛细管电泳在核酸适配体中的亲和作用研究以及用于核酸适配体筛选(CE-SELEX)的主要方法(ECEEM,NECEEM,Non-SELEX和三者比较)和研究进展进行了综述。     

蛋白质的核酸适配体筛选及应用的研究进展

核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)筛选方法获得的,能够与靶标分子高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA。蛋白质是一种非常重要的生物功能大分子,迄今为止,已经开发了许多SELEX技术,用于蛋白质的适配体的筛选。目前,适配体的筛选优化方法主要集中在提高筛选效率、降低筛选成本,以及提升适配体性能等方面,从而获得可与靶标分子以高亲和力和高特异性结合的适配体。适配体与靶标分子亲和力的表征是关键的筛选步骤,用于判定所筛选的适配体是否可以满足后续应用需求。本文归纳总结了2016年以来蛋白质靶标的适配体筛选的研究进展,对核酸适配体筛选过程中有关核酸库的优化方法和筛选方法的改进、新筛选方法的开发、核酸适配体的应用等方面的研究进行了评述。     

毛细管电泳与核酸适配体高效筛选

指数富集配体系统进化(SELEX)技术是核酸适配体筛选的通用技术,精准高效的筛选方法和筛选策略设计是成功筛选适配体的关键。本文概述了本课题组自2007年以来,应用毛细管电泳(CE)技术研究核酸适配体高效筛选的有关工作,包括CE在核酸适配体筛选前、筛选中及筛选后各环节中的分析分离应用、不同蛋白靶的分类及筛选策略、多种CE筛选模式和多尺度靶标的核酸适配体筛选。同时,探讨了SELEX中存在的问题,并对其发展前景进行了展望。     

蛋白质的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体是通过指数富集系统配体进化(SELEX)筛选获得的,与靶标具有高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA。蛋白质是生命进程中的关键功能分子。近年来,以蛋白质为靶标的适配体筛选在蛋白质相关的基础及应用研究领域受到广泛关注。核酸适配体应用性能的优劣取决于其亲和力、特异性与稳定性。目前,适配体筛选方法的优化主要是提高筛选效率、提升适配体性能及降低筛选成本。适配体主要筛选步骤包括复合物分离、核酸库优化、次级库的富集、适配体序列分析以及亲和力表征等。迄今为止,以蛋白质-核酸复合物的分离为核心步骤的适配体筛选方法有20余种。本文归纳总结了2005年以来以蛋白质为靶标的适配体筛选技术,讨论了各方法的缺陷与局限。介绍了核酸库的设计优化方法、适配体的序列特征,以及常用的亲和力表征方法。     

细菌的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选的能够以高亲和力和高特异性识别靶标分子或细胞的核糖核酸(RNA)和单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。作为化学抗体,核酸适配体的制备和合成比抗体的成本更低。核酸适配体的靶标范围极其广泛,包括小分子、生物大分子、细菌和细胞等。针对细菌靶标筛选的适配体,目前主要应用于食品、医药和环境中的细菌检测。细菌的核酸适配体筛选可以通过离心法将菌体-适配体复合物与游离的适配体分离,并通过荧光成像、荧光光谱分析、流式细胞仪分选、DNA捕获元件、酶联适配体分析等方法表征适配体与靶标的相互作用。筛选出的适配体可结合生物、化学检测方法用于细菌检测。本文介绍了细菌适配体的筛选和表征方法以及基于适配体的检测方法的最新进展,分析了不同检测方法的利弊,并列出了2011~2015年筛选的细菌的核酸适配体。     

小分子靶标的核酸适配体筛选研究进展

核酸适配体(Aptamer)作为新型识别分子,在小分子传感分析和检测中有很大的应用潜力。小分子的Aptamer筛选是其应用的前提。本文综述了2015～2019年,有关毒素、抗生素、激素等近80种小分子的Aptamer的筛选研究进展,归纳总结了近百条Aptamer序列和平衡解离常数K_D及其测定方法,简要介绍了基于氧化石墨烯、人类基因组、石英晶体微天平以及计算机辅助筛选等改进型指数富集配体系统进化技术。     

胃腺癌核酸适配体的筛选与特异性研究

核酸适配体可作为分子探针应用于胃腺癌的早期诊断和治疗,具有广泛应用前景。本实验利用Serum-SELEX（Ser-SELEX）技术筛选胃腺癌核酸适配体。通过对候选适配体二级结构分析,其二级结构多为茎环结构。圆二色谱分析显示,7条候选核酸适配体呈右手螺旋特征。通过荧光定量核酸扩增检测系统（q-PCR）检测了候选核酸适配体对胃腺癌靶标的亲和力,表明候选核酸适配体浓度梯度与Ct值均呈正相关,亲和力常数为纳摩尔级别。利用q-PCR法、量子点法验证了候选核酸适配体识别靶标的特异性,结果均显示Apt-101对靶标亲和力更高,特异性更强,Apt-101的平衡解离常数（K_d值）为6.444±1.128nmol/L,特异性检测阳性率大于70%。     

腐霉利核酸适配体的筛选与鉴定

本文通过氧化石墨烯-体外指数富集配体系统进化技术,筛选并获得靶向腐霉利的核酸适配体Pr-A06和Pr-A08,通过二级结构预测,两种核酸适配体形成茎环结构和分子内G-四链体,结构稳定。使用胶体金法初步鉴定Pr-A06和Pr-A08,研究结果表明Pr-A06和Pr-A08解离常数(K_d)分别为42.94±8.142 nmol/L、27.01±6.519 nmol/L,亲和力较好,并且特异性良好。Pr-A06浓度在0.1～1μg/mL之间有良好的线性范围,检测限为0.153μg/mL,Pr-A08浓度在0.05～1μg/mL之间有良好的线性范围,检测限为0.115μg/mL。本研究筛选的适配体为腐霉利的快速检测提供了新条件。     

全细胞的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体(aptamer)是从人工合成的随机单链DNA(ssDNA)或RNA文库中筛选得到的,能够高亲和力、高特异性地与靶标结合的ssDNA或RNA。核酸适配体的靶标范围广,可包括小分子、蛋白质、细胞、微生物等多种靶标。其中以细胞为靶标的适配体在生物感应、分子成像、医学诊断、药物传输和疾病治疗等领域有很大的应用潜能。但全细胞的核酸适配体筛选过程复杂,筛选难度大,筛选的适配体性能不佳是导致目前可用的适配体非常有限的主要原因。由于细胞表面蛋白质在提取纯化过程中分子结构和形态会发生改变,故以膜表面蛋白质为靶标筛选的适配体很难应用于识别整体细胞。以全细胞为靶标的核酸适配体筛选则不需要准确了解细胞表面的分子结构,筛选过程中可保持细胞的天然状态,以全细胞为靶标筛选出的核酸适配体有望直接用于全细胞识别。本文总结了2008~2015年全细胞的核酸适配体筛选的研究进展,介绍了靶细胞的分类、核酸库的设计、筛选条件和方法以及核酸适配体的亲和力表征方法等。并列出全细胞靶标的核酸适配体序列。     

小分子靶标的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选得到的核糖核酸(RNA)或单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。核酸适配体通过高亲和力特异性地识别小分子、蛋白质、细胞、微生物等多种靶标,在生物、医药、食品和环境检测等领域的应用日渐增多。但目前实际可用的核酸适配体有限,其筛选过程复杂,筛选难度大,制约了其应用。与生物大分子、细胞和微生物等靶标不同,小分子靶标与核酸分子的结合位点少、亲和力弱,且靶标通常需要固定在载体上。此外,小分子靶标结合核酸形成的复合物与核酸自身的大小、质量、电荷性质等方面差异较小,二者的分离难度大。故小分子靶标的核酸适配体筛选过程与大分子和细胞等复合靶标相比有明显差异,筛选难度更大。因此需要根据其自身结构特点和核酸适配体的应用目的选定靶标或核酸库的固定方法,优化靶标核酸复合物的分离方法。本文介绍了不同类型小分子(具有基团差异的单分子、含相同基团分子和手性分子等)靶标的选择及其核酸适配体的筛选方法,并对核酸库的设计、与靶标结合的核酸的分离方法和亲和作用表征方法进行了介绍,列出了自2008年以来报道的40余种小分子靶标的核酸适配体序列和复合物的平衡解离常数(K_d)。     

SELEX筛选核酸适配体富集水平理论分析

指数富集的配基系统进化(SELEX)方法是一种新颖的筛选技术,能从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到核酸适配体.根据SELEX原理,与靶标亲和性最强的核酸适配体应该具有最高的富集水平.然而,SELEX实验很少出现这种现象.本文采用数学方法,论证了在满足一定实验条件时,与靶标亲和性最强的核酸适配体并不具有最高的富集水平,并指出了较大的靶标浓度、较低的分离效率会促使这种现象的产生.     

哈维氏弧菌与溶藻弧菌共有核酸适配体的筛选及鉴定

共有位点是指不同微生物上结构相同或相似的位点,有些共有位点是同种或同属微生物所共有的,可以作为微生物种属鉴定的标记位点。因此,筛选这些共有位点的共有核酸适配体,不仅有助于对这些微生物进行总量分析,对于相关微生物的种属鉴定也具有重要意义。本研究以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为靶目标,筛选这两种弧菌共有位点的共有核酸适配体。经过8轮筛选,适配体富集库的亲和力提高了24.1倍,同源性分析表明,适配体富集库呈明显的收敛性,表现了较好的筛选效率。对2个核酸适配体C14和C22的亲和性和特异性进行了研究,结果表明,这两个核酸适配体对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好的亲和性和特异性,但对哈维氏弧菌的亲和力要显著高于溶藻弧菌,而对非弧菌属的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的亲和力较弱。C14对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和常数(K_d)分别为55.76和82.88 nmol/L, C22对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和常数分别为33.97和43.9...     

核酸适配体在微流控芯片中筛选及病毒性疾病中应用

核酸适配体是短的、单链DNA或RNA序列。相较于抗体成本高、不稳定、免疫原性、难修饰的问题,核酸适配体作为新一代亲和试剂,有着免疫原性低、易修饰、靶标范围广等优势。通过指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)可获得与靶标分子特异性结合的核酸适配体,而如何提高核酸适配体筛选效率是核酸适配体广泛应用的一个瓶颈问题。目前,提高核酸适配体筛选效率的方法种类较多,而微流控SELEX的发展,加速了核酸适配体的发现。核酸适配体作为各种靶标的识别分子,具有诊断和治疗特定疾病的潜力。鉴于此,本文重点介绍核酸适配体在微流控芯片领域进行筛选的研究进展,以及阐述其在病毒性疾病中的应用以及展望。     

核酸适配体在质谱中的应用与展望

核酸适配体(简称适配体)是一类重要的"化学抗体"型功能性生物分子,基于适配体的质谱技术在提供分子质量及结构特征等基础上,兼具了针对靶分子的高选择性及亲和富集特点,从而提供出高特异、高灵敏信息。本文综述了近年来适配体在质谱分析中的应用进展,重点评述了适配体在质谱分子相互作用表征中的应用、适配体作为离线型和在线亲和材料用于质谱分析测定等现状,其中结合多种质谱新技术,通过创建或结合多种前处理或在线一体化信号增强方式,特别是适配体功能化纳米材料的应用,在相互作用表征、痕量靶分子选择性提取和高灵敏检测等质谱分析测定方面是研究的重点。最后,本文对适配体在质谱研究中的应用前景进行了展望。     

毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究

毛细管电泳(CE)被认为是核酸适配体筛选的高效方法,其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离高效,样品用量少,筛选成本低。但由于小分子靶与核酸的结合位点少,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,通常认为CE-SELEX不适用于筛选小分子靶标的适配体。本研究建立了基于CESELEX的盐酸克伦特罗靶标的的适配体筛选方法。将80 nt的ssDNA库与盐酸克伦特罗特混合孵育,通过CZE-UV分离混合物。收集ssDNA库峰前的馏分,通过PCR扩增和ssDNA制备,完成第一轮筛选。将次级核酸库经过3轮筛选,获得10条ssDNA序列。选择3条亲和力较强的序列Apt 4、Apt 7、Apt 12,通过CE-LIF测定其与盐酸克伦特罗的K_d分别为9.315×10~(-7)mol/L、1.040×10~(-6)mol/L和1.143×10~(-5)mol/L。软件分析表明,上述3条序列均可形成茎环二级结构,其中Apt 4茎环结构的自由能最低,结构最稳定。以沙丁胺醇为对照,验证了3条序列,具有较高的特异性。     

基于微流控芯片的核酸适配体筛选技术研究进展

适配体(Aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的,可与靶标分子以高亲和力特异性结合的单链DNA或RNA,在生物分离分析、临床诊断和疾病靶向治疗等领域应用广泛。适配体的发展与筛选技术的进步密切相关,以SELEX为基础,研究者开发了磁珠SELEX和毛细管电泳SELEX等多种适配体体外筛选技术,但这些方法存在筛选轮次多、筛选周期长和样品消耗量大、对小分子筛选效率低等缺点。微流控芯片具有体积小、高通量和易集成等特点,基于微流控芯片的SELEX技术在一定程度上可解决上述问题,实现适配体快速、高通量的体外筛选。本文在总结SELEX及其关键技术要点的基础上,重点评述了基于微流控和微阵列芯片SELEX技术的研究进展,并对SELEX技术中未来的发展方向进行了总结和展望。     

毛细管电泳法筛选脱铁转铁蛋白的核酸适配体及筛选影响因素分析

核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术,在体外筛选获得的与目标分子有高亲和力与特异性的寡核苷酸序列。由于筛选过程周期长且影响因素复杂,使用常规筛选方法进行多因素影响的条件优化的工作量大,样品消耗多,目前还少有系统的研究报道。毛细管电泳(CE)具有高分辨率、快速分离、样品用量小、筛选成本低的优势,是核酸适配体筛选的有效方法。本研究以人血清中脱铁转铁蛋白(A-TF)为模式蛋白,利用CE方法研究核酸库长度、孵育温度、缓冲溶液的种类与pH值、金属离子等因素对靶蛋白与核酸库相互作用的影响。结果表明,较短序列的核酸库与靶蛋白的亲和力更高;孵育温度、缓冲液种类与pH值均影响靶蛋白与核酸复合物的形成;低浓度的K⁺、Ca²⁺与Mg²⁺可促进复合物形成。基于优化的筛选条件,经过3轮毛细管电泳法筛选,获得了A-TF的适配体Seq A3,采用CE-LIF测得复合物的亲和常数K_D=0.476μmol/L。此适配体可用于人血清基质中A-TF的识别。     

核酸适配体在多肽研究中的应用

多肽在生命体的生理过程中发挥着重要作用,其生理功能一直是生物学、药理学和医学等领域的重要研究内容.核酸适配体是经体外筛选获得的单链DNA或RNA,能与靶标高亲和力、高特异性地结合,有"化学抗体"或"化学家的抗体"之称.以多肽为靶标筛选获得的核酸适配体主要有两大用途:一是基于其识别功能,作为亲和试剂来建立分析检测方法或开展生物成像研究;二是基于它们的生物学活性,作为拮抗剂在活体水平影响靶标多肽的正常功能,阻碍下游信号通路,从而对疾病进行治疗.本文总结了近年来以多肽为靶标筛选的核酸适配体在体内及体外的用途,并探讨了其在筛选、表征及应用中存在的问题,并对其未来的发展趋势进行了展望.