基于核酸适配体的荧光法检测水胺硫磷和丙溴磷

建立了基于适配体的农药水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法.采用可特异性识别水胺硫磷和丙溴磷、且5 '端标记荧光基团FAM的核酸适配体(F-ssDNA),与3 '末端标记猝灭基团DABCYL的短链序列(Q-ssDNA)互补杂交形成双链结构,荧光基团的荧光被淬灭,荧光信号很弱;此时加入靶分子,特异性结合核酸适配体,引起互补短链序列从双链结构中解离,使适配体荧光信号增强,基于此可实现水胺硫磷、丙溴磷的定量检测.优化后的检测条件为:将终浓度为25 nmol/L F-ssDNA与50 nmol/L Q-ssDNA在25℃孵育20 min,使二者杂交形成双链适配体探针复合物,加入等体积的农药样品孵育60 min,然后检测体系的荧光信号变化值△I.在最佳条件下,△I与水胺硫磷和丙溴磷的浓度均在50～ 500 μmol/L范围内呈线性关系.水胺硫磷的检出限(LOD,3σ)为11.4 μmol/L,相对标准偏差(RSD)为5.8％(n=10);丙溴磷的检出限为14.0 μmol/L,RSD为4.9％(n=l0).用于实际水样中两种农药的检测,加标回收率为85.8％ ～95.3％.     

基于核酸外切酶Ⅲ信号放大技术的荧光适配体传感器用于卡那霉素的检测

建立了一种基于核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)和碳纳米颗粒(CNPs)的信号放大体系用于卡那霉素(KAN)检测的新方法。合成了水溶性的CNPs,并设计合成了不同序列的DNA,具体包括:卡那霉素适配体(Apt),羧基荧光素标记的信号DNA探针(FAM-DNA)和互补链cDNA。当体系中不存在KAN时,Apt与cDNA可以杂交形成双链DNA,体系中FAM-DNA处于单链状态,Exo Ⅲ不能水解单链DNA;此时,体系中加入CNPs,单链FAM-DNA被CNPs吸附,荧光发生淬灭;在KAN存在下,Apt与其靶标KAN特异性结合,此时FAM-DNA与cDNA杂交形成双链DNA,由于CNPs对双链DNA吸附较弱,DNA探针的荧光不发生淬灭。ExoⅢ可以特异性的从3’-端对FAM-DNA降解,释放FAM荧光团和cDNA,该体系通过"降解-杂交"循环,最终释放出大量的FAM荧光团。由于CNPs对FAM具有较低的亲和力,释放出的FAM不能吸附在CNPs表面,FAM荧光不会发生淬灭,实现荧光信号放大扩增作用。方法线性范围为50～100 nmol/L,检测限为2.5 nmol/L。该方法可用于实际样品牛奶中卡那霉素的检测。     

基于石墨烯猝灭及核酸外切酶辅助循环放大适体传感器检测ATP

基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助分析物循环放大原理,结合石墨烯(G)的超高荧光猝灭能力,以三磷酸腺苷(ATP)作为模型分析物,构建了一种新型的荧光探针,实现了ATP的高灵敏检测。两条DNA链各包含一部分ATP适体序列,其中1条DNA链的3'端修饰有荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)。当模型分析物不存在时,两条DNA链通过非共价π-π堆积作用吸附在G表面,导致FITC的荧光猝灭。当目标物ATP存在时,两条DNA链与目标物ATP进行特异性结合,形成一双链夹心结构,随后加入ExoⅢ,由于ExoⅢ可对该双链夹心结构的3'凹陷末端进行逐步水解,释放出目标物ATP和游离的FITC。释放出的目标物ATP可继续进入下一循环,不断产生游离FITC,游离FITC将脱离G表面,从而导致体系的荧光恢复,并且恢复的荧光强度与ATP浓度在0.02~1μmol/L范围内存在良好的线性关系,检出限(S/N=3)为9 nmol/L。     

双链特异性核酸酶介导的高灵敏度microRNA分析

基于氧化石墨烯(GO)对荧光标记单链DNA探针的荧光猝灭效应以及双链特异性核酸酶(DSN)选择性切割DNA/RNA杂合结构中DNA单链的特性,本文建立了一种新型恒温信号放大方法用于microRNA(miRNA)的高灵敏度检测.靶标miRNA首先与荧光DNA探针杂交,DSN能够特异性地将杂合双链中的DNA探针水解为碎片但不会降解miRNA,GO对酶切产生的寡核苷酸碎片吸附能力显著降低,使得荧光基团远离GO表面而不被猝灭.释放出的miRNA可再次发生与荧光DNA探针杂交、DSN酶切等反应,如此反复,可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程,最终体系的荧光信号得到显著放大,通过记录体系的荧光信号即可实现对靶标miRNA的灵敏检测.     

基于链置换循环无标记检测端立酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂,SYBRGreen Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针,发夹核酸探针为分子识别探针,基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应,建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA (hTR)的荧光新方法.发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面,嵌插在发夹DNA探针茎部的SG Ⅰ的荧光信号被GO猝灭.当人工合成的目标物(T1)存在时,T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应,由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链.刚性的双链DNA脱离GO表面,导致所嵌插的SG Ⅰ产生较强的荧光信号.基于荧光信号的变化,可定量检测0.2～50 nmoL/L的T1,检出限为90 pmol/L.该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、高特异性且无需标记的荧光新途径.     

基于核酸适配体和金纳米颗粒的荧光比色双模式检测As(Ⅲ)

基于金纳米颗粒(AuNPs)对荧光基团的荧光共振能量转移和其自身独特的光学效应,结合高亲和力和高特异性的核酸适配体,建立了一种荧光和比色双模式检测As(Ⅲ)的方法.将荧光基团修饰的As(Ⅲ)特异的核酸适配体(FAM-Apt)吸附在未修饰的AuNPs表面,FAM-Apt与AuNPs之间发生荧光共振能量转移,导致荧光猝灭....     

基于链置换循环无标记检测端粒酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂, SYBR Green Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针, 发夹核酸探针为分子识别探针, 基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应, 建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA(hTR)的荧光新方法. 发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面, 嵌插在发夹DNA探针茎部的SGⅠ的荧光信号被GO猝灭. 当人工合成的目标物(T1)存在时, T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应, 由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链. 刚性的双链DNA脱离GO表面, 导致所嵌插的SGⅠ产生较强的荧光信号. 基于荧光信号的变化, 可定量检测0.2~50 nmol/L的T1, 检出限为90 pmol/L. 该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、 高特异性且无需标记的荧光新途径.     

基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷

本文提出了一种基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷(ATP)的传感策略。磁性纳米粒子表面易于修饰,而且操作方便,具有很好的分离效果,能够提高生物传感的选择性。首先,利用生物素与链霉亲和素之间的亲和力作用,将生物素标记的ATP核酸适配体连接到链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子表面,加入与ATP核酸适配体互补的一段DNA进行杂交,通过磁性分离除去未杂交上的DNA,加入靶向ATP,ATP与其适配体特异性结合将适配体的互补链通过磁性分离出来,磁性分离出的信号DNA继续用于下一步的杂交链反应,将信号放大,最后利用氧化石墨烯(GO)对荧光的猝灭效应降低背景荧光,达到高灵敏度、高选择性检测靶向ATP。其中,ATP的最低检测浓度为0.1nmol/L。     

基于非标记适配体结构变化荧光法检测黄曲霉毒素B1

构建了一种基于非标记适配体结构变化荧光检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的方法。无AFB1时,一条非标记的AFB1适配体同时与2条短互补DNA链杂交,形成DNA双链结构,导致标记于其中一条互补DNA的3’端的荧光素（FAM）与标记于另一条互补DNA的5’端的淬灭剂（BHQ1）相邻近,发生荧光共振能量转移,FAM荧光被BHQ1淬灭。AFB1存在时,适配体与AFB1结合,而不与互补DNA发生杂交。此时,FAM与BHQ1距离较远,FAM荧光不能被淬灭。通过测量体系荧光强度变化可定量检测AFB1。方法检出限0.2 nmol/L,定量检测范围1.0 nmol/L～4.0μmol/L。该方法无需共价标记适配体,操作简便,特异性好,能够用于检测复杂基质样品中的AFB1。     

基于核酸适配体-质粒DNA复合物信号放大的荧光免疫传感技术

提出了一种简便、高灵敏的荧光免疫传感新技术,通过抗体/抗原/核酸适配体-质粒DNA复合物的特异性识别与双链质粒DNA与荧光染料SYBR Green Ⅰ的嵌合作用, 实现对血小板衍生增长因子BB(PDGF-BB)的检测.生物识别反应在微孔板中进行,PDGF-BB抗原与微孔板底部预包被的PDGF-BB抗体免疫反应后,加入核酸适配体-质粒DNA复合物与抗原形成夹心复合物.加入DNA双链嵌合染料SYBR Green Ⅰ与夹心复合物的双链DNA部分结合可产生强荧光,其荧光强度可用于定量测定PDGF-BB浓度.实验考察了离子浓度、核酸适配体的延伸引物片段与质粒PUC19的反应比例、染料SYBR Green Ⅰ浓度等分析条件对荧光信号的影响.在优化反应条件下,PDGF-BB检测的线性范围为0.2～200 μg/L,检出限为0.1 μg/L,并且实现了对人血清中PDGF-BB的定量检测.     

基于无标记的核酸适配体荧光生物传感器检测凝血酶

设计了一个简单、通用、基于核酸适配体无标记的高敏感、高专一检测凝血酶的荧光方法。以无标记凝血酶核酸适配体单链DNA为识别元素,Pico Green染料传导互补双链的荧光信号。Pico Green是一种不对称菁,当其单独存在时不产生荧光信号,而当其被吸附到互补的双链DNA上时,可产生很强的荧光信号,但被吸附到单链DNA上时,却无明显的信号改变。基于该性质,将其用于凝血酶的检测。该方法对凝血酶的响应线性范围为1.0×10~(-14)~1.0×10~(-7)mol/L,相关系数(r~2)为0.99,检出限为1.0×10~(-14)mol/L。1.0×10~(-8)mol/L两种干扰物质(牛血清蛋白和细胞色素C)的存在不影响凝血酶的检测,表明该方法对凝血酶具有非常好的专一性。该方法成功应用于对人血清样品的检测,其平均回收率为97%~102%。方法可简单、灵敏、特异性地检测凝血酶,有望用于医学临床诊断等领域。     

核酸适配体介导的荧光铜纳米簇用于免标记快速检测水胺硫磷

基于核酸适配体的靶标识别能力和铜纳米簇（CuNCs）优良的荧光性能,本研究开发了一种免标记荧光探针用于有机磷农药水胺硫磷（ISO）的快速检测。当靶标分子ISO不存在时,溶液中ISO的核酸适配体和互补DNA形成双链结构,从而介导合成荧光CuNCs,表现出高的荧光信号;当待测样品中存在ISO时,ISO与其核酸适配体形成复合物,释放出单链互补DNA。游离的单链DNA不能介导合成CuNCs,导致溶液中的荧光信号减弱。在最佳条件下,检测体系的荧光抑制率与ISO浓度的对数在0.05～25 mg/L浓度范围内呈线性关系,检出限为47μg/L (3σ),其它物质对其检测几乎没有干扰。将此探针用于检测水样中的ISO,回收率为80.3%～108.0%。研究结果表明,本方法可用于检测实际样品中的ISO残留。     

(E)-2-乙氧基乙基-2-氰基-3-((4-(2,4-二氟苯氧基)苄基)氨基)-3-甲氧基丙烯酸酯对超螺旋质粒DNA的特异性切割(英文）

研究了一种新型丙烯酸酯 (E)-2-乙氧基乙基-2-氰基-3-((4-(2,4-二氟苯氧基)苄基)氨基)-3-甲氧基丙烯酸酯(MAZ)对超螺旋pUC19 DNA的定点切割作用。利用紫外吸收、荧光光谱、凝胶电泳和DNA测序技术研究其核酸切割特异性。紫外吸收光谱的红移和减色效应,以及静态荧光淬灭表明MAZ与DNA的作用属于典型的插入模式。不仅如此,凝胶电泳条带的变化以及DNA测序结果表明DNA的定点切割是通过DNA双链的分步水解完成。     

核酸适配体识别-荧光法检测赭曲霉素A

建立了核酸适配体识别-荧光探针技术检测赭曲霉素A(OTA)的新方法.基于微孔板上固定的核酸适配子与目标物质OTA结合时构象发生变化,导致预先与其互补杂交的FAM标记短链DNA解离,引起荧光信号发生变化,据此可实现对OTA的定量检测.当微孔板包被亲和素浓度为25 mg/L、适配子浓度为50 nmol/L,FAM标记互补短...     

基于计时库仑技术的可再生型三磷酸腺苷适配体电化学传感器的研究

构建了一种可再生型三磷酸腺苷(ATP)适配体计时库仑电化学传感器.将一条短链DNA通过AuS键自组装固定在电极表面, ATP的核酸适配体与该短链DNA杂交而结合在电极表面.带负电的DNA通过静电吸引结合电解液中的六氨合钌(RuHex)阳离子.当传感器和靶分子ATP孵育后,ATP与核酸适配体结合,使适配体链从电极表面解离,电极表面吸附的DNA量减少,结合RuHex的量随之降低.通过计时库仑技术检测RuHex响应信号降低的量 ,可以对ATP进行定量测定.此传感器的电化学响应信号与ATP浓度对数值呈线性关系,线性检测范围为0.001~100 μmol/L,检出限(S/N=3)为0.5 nmol/L.此传感器检测靶分子ATP后,可以通过简单的操作步骤再生,再生5次后的响应信号为初始信号的90%以上.采用此传感器检测大鼠脑透析液中ATP的含量为(19.2±3.7) nmol/L (n=3).     

基于发夹结构DNA铜纳米簇的链霉素快速检测

建立了基于铜纳米簇(CuNCs)的免标记荧光生物传感器快速检测链霉素的方法。利用链霉素核酸适配体和双链茎设计并合成了发夹结构DNA(hpDNA)模板,富含AT的双链茎部分可以合成CuNCs。在CuNCs荧光传感体系中加入链霉素后,链霉素与核酸适配体结合,使hpDNA双链茎打开,CuNCs荧光强度明显下降。在优化条件下,该方法检测链霉素的线性范围为0.1～20 mg/L,线性回归方程为y=240.17-10.31x,线性回归系数r²为0.9954,检出限为4.36μg/L。该方法对牛奶样品的加标回收率为98.6%～104.8%。方法无需复杂的DNA序列设计、荧光标记,实验操作简单易行,适用于链霉素的快速检测。     

基于封闭链释放型磁性DNA分子机器的化学发光传感体系

以核酸外切酶Ⅲ(EXO Ⅲ)作为驱动力,构建了一种卸载封闭链激活DNAzyme的磁性DNA分子机器,用于化学发光传感分析。将含有富G序列的DNA固定在磁性微球上,并用封闭链封闭富G片段,当有目标DNA存在时,在EXO Ⅲ的作用下,目标DNA可以循环地将封闭链从磁性微球上卸载,使磁性微球表面生成G-四链体DNAzyme,催化产生化学发光,定量检测目标DNA。该DNA分子机器仅需30 min便可完成循环过程。通过紫外吸收、分子荧光、化学发光、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法验证了DNA分子机器的工作原理。最佳条件下,该分子机器检测DNA的线性范围为10～200 pmol/L,检出限3.2 pmol/L。该磁性DNA分子机器在低丰度DNA检测中具有良好的应用前景。     

基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅(Ⅱ)

利用核酸切割酶(Nicking endonuclease)识别特定DNA双链并切割其中某条单链的性质,构建了基于8-17E脱氧核酶(8-17E DNAzyme)的pb2+荧光循环放大检测方法.pb2+可激活8-17E脱氧核酶水解RNA底物,产生并释放出的单链与分子信标探针( Molecular beacon,MB)杂交,导致其茎环结构被破坏,荧光信号恢复;同时形成含有核酸切割酶Nt.BbvCI识别位点的双链区域.在核酸切割酶Nt.BbvCI的作用下,分子信标探针被切割释放,游离出来的单链可与其它分子信标重新杂交,从而触发下一轮酶切,引起荧光检测信号的循环放大.本方法避免了8-17E脱氧核酶与底物链的修饰,最低可以检测出水溶液中1.0×10-10 mol/L Pb2+,并在2倍浓度的Zn2+,以及5倍浓度的其它干扰金属离子存在的情况下对pb2+显示出良好的选择性.本方法对环境水样中pb2+的标准加样回收率为96.1％～108.0％.     

基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光碎灭性质的核酸检测方法

将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与MoS2纳米片的荧光猝灭性质结合,构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法.首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸(HP1和HP2).由于两条探针核酸具有3'粘性末端,使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解,因而被吸附于MoS2纳米片而猝灭其荧光.当目标DNA存在时,会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应,并将探针核酸降解成大量的不能吸附于MoS2纳米片表面的荧光碎片.在优化条件下,目标DNA浓度在0.5~6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系,检出限为0.28 pmol/L.与单重信号放大技术相比,本方法极大改善了分析灵敏度和检出限,且具有良好的单碱基错配区分能力.     

细菌的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选的能够以高亲和力和高特异性识别靶标分子或细胞的核糖核酸(RNA)和单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。作为化学抗体,核酸适配体的制备和合成比抗体的成本更低。核酸适配体的靶标范围极其广泛,包括小分子、生物大分子、细菌和细胞等。针对细菌靶标筛选的适配体,目前主要应用于食品、医药和环境中的细菌检测。细菌的核酸适配体筛选可以通过离心法将菌体-适配体复合物与游离的适配体分离,并通过荧光成像、荧光光谱分析、流式细胞仪分选、DNA捕获元件、酶联适配体分析等方法表征适配体与靶标的相互作用。筛选出的适配体可结合生物、化学检测方法用于细菌检测。本文介绍了细菌适配体的筛选和表征方法以及基于适配体的检测方法的最新进展,分析了不同检测方法的利弊,并列出了2011~2015年筛选的细菌的核酸适配体。