污水中环丙沙星对活性污泥胞外蛋白质组学的影响研究

为了考察活性污泥法处理含环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)废水时污泥与CIP的相互作用,本文采用液相色谱-串联质谱研究CIP影响下活性污泥中胞外蛋白质的表达谱,并进行基因本体注释分析.在未投加CIP的对照组和CIP组中分别鉴定出高可信度蛋白质89和97种,相同表达蛋白质仅13种,差异显著.对照组和CIP组胞外蛋白质具有相似的等电点分布, CIP组大分子量胞外蛋白质增多.从亚细胞定位来看,对照组和CIP组分别有62.9%和66.0%的蛋白质细胞定位已知,说明大部分胞外蛋白质源于细胞裂解释放,CIP加入后胞外蛋白质发生了更新和重组,为CIP的吸附提供了结合位点;CIP的加入导致定位于细胞核的蛋白质显著减少.从分子功能和生物学过程来看, CIP的加入抑制了与DNA和RNA的结合、合成、转录等分子功能相关的蛋白质的表达,阻碍了DNA和RNA的转录、分解代谢等生物学过程;激发了具有核酸修复、蛋白质结合和架桥等分子功能的蛋白质的表达,促进了核酸损伤修复、应急反应、萜类化合物合成、蛋白质合成和代谢等生物学过程. CIP抑制了对照组中高丰度蛋白质的表达.可见, CIP通过影响活性污泥的生物...     

氟离子核糖开关调控行为的动力学研究

核糖开关位于RNA(ribonucleic acid)的非编码区,参与调控很多重要的生物过程。本文利用已发展的RNA转录折叠预测方法,研究了位于Thermotoga petrophila中的氟离子核糖开关。计算结果表明,该核糖开关在转录过程中先折叠成一个包含假结并可以特异性结合配体的适体域结构。当氟离子浓度较低时,随着RNA序列的延长,转录终止子开始成核、延长,最终完全形成,引起转录提前终止;当氟离子浓度较高时,配体和适体域结构结合形成一个稳定的复合体结构,阻止了转录终止子的形成,从而使得下游基因可以正常表达。该核糖开关受转录速度和配体浓度的联合控制,体现出动力学调控特性。     

重组家蚕核多角体病毒（rBmNPV）的复制及所载HuIFN－α基因的表达

报道了重组家蚕核多角体病毒（ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｎｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓＢｍＮＰＶ）在家蚕细胞ＢｍＮ中复制的细胞病理学变化，除了不形成多角体以外，与野生型病毒相同．研究了病毒感染复数、细胞接种密度和细胞生长阶段对重组病毒复制和α－干扰素（ＩＦＮ－α）表达量的影响．在一定低感染复数时，α－干扰素的产量较高．对于重组病毒的复制，最适的细胞接种密度为３．６～７．０×１０５细胞／瓶．在细胞指数生长前期（４８～６０ｈ）接种重组病毒，对于获得较高的重组病毒复制效价和α－干扰素的产量都是有利的．     

草鱼NF-κB2和IκBα基因的组织分布及对GCRV病毒感染的应答分析

NF-κB是具有多向性调节作用的蛋白质分子,NF-κB信号通路通过调控免疫相关基因的表达在鱼类先天性免疫中发挥重要作用,对该信号通路中2个关键信号分子NF-κB和IκB基因结构和表达模式研究非常重要。本文中,我们克隆了草鱼的NF-κB2和IκBα2个基因。氨基酸序列分析显示,NF-κB2含有1个RHD结构域、1个IPT结构域、6个ANKs结构域和1个Death结构域;IκB含有7个ANKs结构域。Real-time PCR分析发现,健康鱼体内NF-κB2在肝脏组织中表达量最高,IκBα在肾中表达量最高。GCRV病毒感染后,NF-κB2在肠中出现了显著的上调表达;IκBα在肝脏中产生了显著的下调表达,在肠中出现了小幅度的上调表达。说明NF-κB2和IκBα在病毒感染后的肝脏和肠中产生了主要的免疫应答,具体应答机制还有待进一步的研究。本研究结果为NF-κB2和IκBα在硬骨鱼类的抗病毒功能研究提供了重要线索。     

葡萄膜炎患者外周血单核细胞表达的疾病相关细胞因子的检测

用ELISA测IL-12、IFN—γ水平；用原位杂交染色法测IL—12 mRNA表达；电泳迁移率改变试验(EM—SA)测NF—AT活性。结果表明：葡萄膜炎患者PBMCIL—12、IFN—γ水平和IL—12m RNA表达以及NF—AT活性都显著高于正常对照和其他眼疾病患者(P＜0．01)．IL—12、IFN—γ水平异常增高是葡萄膜炎患者Th1／Th2功能紊乱、Th1细胞功能亢进主要原因之一；而在转录水平上NF—AT活性异常增高可能与患者IFN—γ基因转录增强密切相关。     

C9orf72突变致病的分子机制

C9orf72突变是导致肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆最主要的突变形式,该突变由GGGGCC长重复序列插入C9orf72基因的内含子中造成.该突变有3种致病机制:由C9orf72蛋白表达量降低造成的功能缺失、长重复序列RNA造成的细胞毒性、长重复RNA转录产物造成的细胞毒性.本文就从3个方面综合分析了该突变的分子学致病机制,从RNA和蛋白质代谢以及核仁应激三方面总结了3种致病机制之间的联系,并对该突变致病机制研究遇到的困难和未来发展方向进行了总结和预测.     

带瘤供体脾脏核糖核酸的研究

本文对带瘤小鼠及肿瘤患者的脾RNA的传递免疫反应的能力进行了实验研究。用淋巴细胞——肿瘤细胞混合培养法对带S_(180)小鼠的脾RNA进行的体外培养实验表明,正常小鼠的淋巴细胞与带S_(180)小鼠的脾RNA温育后可以转变成为对S_(180)瘤细胞致敏的淋巴细胞。表现为在混合淋巴细胞——瘤细胞培养中的淋转率的提高。这就说明带瘤鼠的脾RNA可以有正常淋巴细胞传递抗S_(180)免疫反应的功能。在小鼠的活体抑瘤实验中,带S_(180)小鼠的脾RNA可对接种S_(180)小鼠的肿瘤生长有33.0—66.9％的抑瘤率,用正常脾RNA则没有效果;同样,用从胃癌患者切除的脾脏中提取的RNA对胃癌患者进行免疫治疗时,治疗组的四年存活率可达47.1％,对照组则为22.7％,治疗组的几项免疫指标均较治疗前有所提高。上述各项体外及活体实验的结果都说明带瘤供体的脾RNA可以传递特异的抗肿瘤免疫反应的信息,其效应和前人所报告的从免疫动物脾中提取的免疫RNA是完全一致的。     

海滨锦葵早期盐胁迫应答基因表达

利用cDNA扩增片段长度多态性(cDNA amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)对盐胁迫下海滨锦葵早期根和叶片的基因差异表达进行了分析.结果表明,海滨锦葵早期盐胁迫应答基因的表达模式可以分为4类:抑制表达、重新诱导、上调表达和下调表达.对38个差异表达的盐胁迫应答基因片段进行了回收测序和BLASTX比对,其中34个差异表达片段与其他物种有高度同源性,4个差异表达片段为新基因片段.进一步对其中的6个差异表达基因的转录水平进行的实时RT-PCR相对定量分析,Avp1,Nhx1和Oat在根和叶中都上调表达;Gapdh和Pmp在根中下调表达而在叶中却上调表达;Chx1在根中上调表达而在叶中却下调表达.盐生植物海滨锦葵在盐胁迫的早期阶段可能通过细胞离子区域化以调节离子平衡外,还可能在整株水平上把钠离子区域化到根部.     

推定的BB0462蛋白增强oppAⅤ启动子的转录活性

Borrelia burgdorferi基因组中BB0462 ORF编码一种由110个氨基酸组成的未知功能BB0462蛋白．使用推定的氨基酸序列在蛋白库中进行Blast比对以及推定蛋白的二级结构预测的结果都显示BB0462蛋白与YhaB家族的蛋白类似．共转化后β-半乳糖苷酶活性分析发现BB0462蛋白增强了B．burgdorferi lp54质粒携带的oppAⅤ上游调控区的转录活性，而对其他4个oppAⅠ～Ⅳ上游调控区调控区的转录活性没有影响．利用纯化的BB0462融合蛋白在体外分别与oppAⅠ～Ⅴ调控区DNA片段进行凝胶阻滞分析，发现BB0462蛋白仅与邻近oppAⅤ基因转录起始点的一段409bp上游调控区DNA结合．用未标记的oppAⅤ上游调控区DNA与DIG-标记的oppAⅤ上游调控区DNA竞争BB0462蛋白，使凝胶上的DNA迁移阻滞带完全消失．β-半乳糖苷酶活性分析和凝胶阻滞分析表明BB0462蛋白在oppAⅤ基因表达的转录调控中可能起重要作用．     

重组干扰素、趋化因子合剂对草鱼免疫保护作用

草鱼细菌性和病毒性疾病严重制约着草鱼养殖生产的发展。干扰素和趋化因子为鱼类重要的非特异性免疫因子,参与鱼类抗病毒、免疫调节等反应。在已克隆的1个草鱼Ⅰ型干扰素基因(GU139255)和CCL4基因(EU918199)的基础上,通过大肠杆菌表达系统分别获得了其相应的表达蛋白。利用喷雾法将这两种蛋白分别或混合添加到饲料中并投喂草鱼,利用攻毒实验验证这两种蛋白对草鱼的免疫保护作用。结果显示:单独添加重组IFN或CCL4后能有效提高草鱼存活率,免疫21 d时其成活率分别为63.33%和46.67%。当同时添加重组IFN和CCL4后,免疫保护效果则更为明显,21 d时草鱼存活率为73.33%,免疫保护率达69.23%。而且,重组IFN和CCL4能够诱导内源IFN、IRF1、STAT3、CCL4表达上调,而两者混合的蛋白诱导效果更为强烈。提示混合的Ⅰ型干扰素和CCL4重组蛋白可以作为一种新型鱼类免疫制剂。     

猪瘟病毒NS3蛋白的原核表达纯化和抗体制备

以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.     

喉癌患者血浆及组织中长链非编码RNA的检测及临床意义

为研究长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)RP11-552E20.1-001在喉鳞状细胞癌患者血浆和组织中的表达水平及临床价值,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)方法,检测67例喉癌患者手术前后一周的血浆,以声带息肉患者血浆作对照,观察喉癌组织、转移的淋巴结和癌旁正常黏膜组织的表达情况,分析其与喉癌临床病理学特征的联系,构建受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC),探讨其诊断价值.研究发现,喉癌患者血浆Lnc RNA表达水平高于声带息肉患者,且术后较术前显著降低;喉癌组织中该链表达较癌旁组织上调,转移的淋巴结比原发病灶表达水平更高;术前血浆及喉癌组织中该链表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移和TNM分期显著相关.ROC曲线下面积为0.734,其敏感性为80.6%,特异性为67.2%.提示该Lnc RNA可能是喉癌诊断的潜在标记物,并在喉癌的侵袭、转移过程中起重要作用.     

果蝇heix基因启动子的分析及其转录活性鉴定

采用生物信息学的方法,综合运用启动子预测工具Promotor Scan1.7和BDGP(neural network pro-moter prediction)分析了目标序列的启动子特征,以果蝇基因组DNA为模板扩增出heix基因启动子候选序列连接至pMD19T载体,构建了荧光素酶报道基因重组质粒pHeixpromoter-Luc,转染果蝇S2细胞表达荧光素酶,并测定了荧光素酶的活性.预测出4个候选的heix基因启动子序列,发现存在ATF、MLTF、c-fos_US5等多种转录因子调控基序;成功构建了pMD19T-Heixpromoter和pHeixpromoter-Luc重组质粒.与肌动蛋白启动子(actinp romoter)相比,pHeixpromoter-Luc表达出的荧光素酶也有较强的活性.本研究找到了果蝇heix基因启动子候选序列,并发现多种转录调控元件,其荧光素酶报告基因实验说明果蝇heix基因启动子与肌动蛋白启动子有相当的转录活性.     

RING3表达沉默细胞系的构建及其对Cyclin A的诱生

应用RNA干扰技术，建立了RING3 （ really interesting gene3）表达沉默的细胞系，研究了RING3内生水平的表达与其可能的靶基因CyelinA之间的关系．结果表明，在血清饥饿的成纤维细胞NIH／3T3中，用血清刺激后会引起细胞周期蛋白CyelinA的表达；当用RNAi技术使RING3表达抑制后，CyclinA的表达受到相应影响，可见CyclinA的表达受到RING3的调节，其转录激活受到RING3和E2F-1等因子的共同调控，表明RING3与肿瘤发生之间的关系可能与CyclinA的表达有关．     

荷包红鲤自噬相关基因LC3B的克隆及在重金属镉胁迫下的表达

微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1light chain 3,LC3)是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因8(ATG8)的同源物,其LC3B亚型的表达强度与自噬泡数量的多少成正相关,为自噬发生的标志蛋白之一。应用RACE-PCR技术克隆了婺源荷包红鲤LC3B基因的cDNA全长序列,用RT-PCR方法检测了该基因在荷包红鲤主要组织中的表达,并用Real-time quantitative PCR方法检测了该基因在镉胁迫下转录水平的变化,以初步揭示该基因在镉胁迫下的作用。结果表明,荷包红鲤LC3B基因cDNA全长为2 138bp,其中开放阅读框长378bp,编码125个氨基酸,预测分子量为14.73kDa,等电点为8.76。序列比对显示,其编码的氨基酸序列和斑马鱼LC3B具有最高的一致性和相似性,并在系统发育树上聚为一支。该基因在荷包红鲤肌肉、脑、鳃、脾脏、肝脏、血液、头肾、肾脏和心脏组织中均有表达;在镉胁迫下,镉诱导显著影响了该基因在肾脏组织中的转录水平。LC3B基因参与的自噬反应可能参与了抗镉毒性作用。     

环状RNA在内分泌与代谢疾病中的研究进展

环状RNA是一种新兴的具有闭合环状结构的内源性非编码RNA, 主要由前体RNA通过可变剪切加工形成的闭合环状RNA分子, 不具有5’端帽子和3’端polyA尾巴结构. 目前研究认为环状RNA具有丰度显著增高、结构稳定、发育阶段特异性表达和物种间保守性等特征, 说明circRNA在基因表达方面有重要的调控作用. 近年来, 研究发现circRNA在肿瘤、糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管系统疾病以及神经紊乱等疾病的发生发展中起着重要的作用, 尤其在内分泌与代谢疾病的发生发展中扮演了重要角色. 因此环状RNA作为新的生物标志物, 为疾病的诊断和治疗提供了新的思路. 本文对环状RNA的结构功能与内分泌代谢疾病的关联以及其潜在临床价值进行了综述.     

RM07 DNA片段在嗜盐古生菌中的启动子功能研究

以二氢叶酸还原酶基因(dhfr)和β-半乳糖苷酶基因(bgaH)为报告基因，利用启动子探针检测技术研究了在大肠杆菌和酵母菌中均具有启动子活性的RM07DNA片段在嗜盐古生菌中的功能，结果从mRNA转录和蛋白质表达水平证明RM07片段在嗜盐古生菌中同样具有启动子功能．缺失分析进一步定位了RM07片段中启动子活性必需的重要功能区，启动子缺失突变分析的结果与序列结构特征分析的结果相吻合．     

VP-16诱导的鼻咽癌细胞亚系多药耐受表型的研究

经VP-16 大剂量短暂冲击加递增低浓度诱导方法建立了鼻咽癌耐药细胞亚系LCE/VP.用RT-PCR和FCM 免疫荧光法检测了耐药基因MRP和m dr1 在m RNA 水平和蛋白质水平的表达,并用MTT 法测定了LCE/VP对9 种化疗药物的敏感试验. 结果发现LCE/VP细胞MRP和m dr1 在m RNA水平均有表达,且前者明显高于后者,蛋白质水平的表达情况与m RNA 水平相一致;LCE/VP对9 种化疗药物中的6 种药物敏感程度均有不同倍数的增加. 这表明LCE/VP呈典型的MDR表型,并有耐药基因MRP和m dr1 的共表达,其中MRP起主要作用     

miR-17-5p调节肝脏胰岛素敏感性的作用机制

探讨miR-17-5p对肝脏胰岛敏感性调节作用及其机制。通过脂质体瞬时转染的方法,将miR-17-5p mimics及inhibitor分别导入HepG2、Hepa1-6及小鼠肝原代细胞中,通过qRT-PCR验证获得microRNA功能获得性及功能缺失性的细胞株,在此基础上进一步检测胰岛素刺激下相关信号通路蛋白表达。在HepG2、Hepa1-6及小鼠肝原代细胞过表达miR-17-5p后,胰岛素信号通路相中p-AKT、p-GSK3β磷酸化增强;反之,p-AKT、p-GSK3β磷酸化减弱。同时发现,过表达miR-17-5p可降低PTEN蛋白表达,抑制miR-17-5p表达后PTEN的蛋白表达量上调。细胞中过表达PTEN可抑制因miR-17-5p过表达增强的p-AKT、p-GSK3β蛋白水平。本研究结果初步证明miR-17-5p通过靶向调节PTEN表达,从而参与调节肝细胞胰岛素敏感性。     

核糖开关——药物开发的新靶点

核糖开关是mRNA上能够与自由代谢产物或其他小分子配体结合或由于环境条件变化而引起构象变化从而调控基因表达的RNA结构元件.核糖开关广泛存在于G+及G-细菌代谢相关基因中,在真菌、植物和高等动物人的血管内皮生长因子基因中也有发现.核糖开关控制生物体内许多重要基因的表达,调节体内基础代谢,信号传递以及氨基酸、核苷酸、辅酶、金属离子的摄取.核糖开关在生物代谢调控、信号传导中的重要作用使其成为一类新型的药物作用靶点,为新型抗生素研发开辟了新的领域.本文综述了核糖开关的研究进展、作用机制、结构功能以及其在开发新型药物方面的研究策略.