SMS沉默对HepG2细胞炎症和CD14表达的影响

肝细胞的炎性损伤与全身性炎症引起的多器官功能障碍的发生相关,LPS可致全身性炎症,在炎症发生过程中,CD14是LPS的膜受体,可通过激活NF-κB诱导炎症相关因子的表达,CD14主要分布于细胞膜脂筏部位,脂筏是由鞘磷脂(SM)和胆固醇相互锚定,并与相关蛋白质组成的一种微空间结构,因此降低SM的合成,会降低SM在脂筏部位的含量,进而改变脂筏结构及CD14在脂筏部位的分布,最终影响炎症的发生。本研究利用干扰载体pSUPER-SMS沉默HepG2细胞鞘磷脂合酶(SMS)的表达,并检测SM在脂筏部位的含量及CD14和TNF-ɑ的表达,结果显示SMS1和SMS2的mRNA水平表达和酶活都有显著下降(P<0.001,n=3),SM在脂筏部位含量和CD14的表达均有显著降低(P<0.001,n=3),导致LPS所致HepG2细胞TNF-ɑmRNA水平的表达下降。可见SMS可通过改变CD14在脂筏部位的含量,最终影响和炎症发生相关分子TNF-ɑ的表达。     

D609增强HT-29细胞对辛伐他汀的敏感性

为了探讨D609能否提高HT-29细胞对辛伐他汀的敏感性及其可能的机制,利用不同浓度的辛伐他汀处理人结肠癌细胞(HT-29)24h,利用MTT法测定并计算出IC50。随后根据上述浓度将HT-29细胞随机分为四组:对照组、D609组、辛伐他汀组和D609+辛伐他汀组,加药处理24h后,采用MTT法检测D609和辛伐他汀对HT-29细胞增殖的影响,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(WB)检测各组RIP140、SMS1、SMS2、BCL-2和BAX的表达。MTT实验结果显示,辛伐他汀可明显抑制HT-29细胞生长,且呈剂量依赖效应,其IC50为:67.98μmol·L-1,而辛伐他汀和D609联用可明显增强辛伐他汀对HT-29的生长抑制作用(P<0.05,n=3)。qRT-PCR和WB实验结果表明D609和辛伐他汀处理均上调了RIP140及BAX的表达,但降低了SMS1、SMS2、BCL-2的表达(P<0.05,n=3),而两者联用可显著增强这些改变(P<0.05,n=3),即D609可提高HT29细胞对辛伐他汀的敏感性,其机制可能与D609通过抑制SMS的活性和增加RIP140的表达有关。     

小鼠动情周期与脂多糖激发TNFα产生关系

观察小鼠于动情周期不同阶段腹腔注射（ip）脂多糖（LPS）时血浆TNFα含量及肝脏、腹腔巨噬细胞和卵巢组织中TNFα mRNA表达的变化。用阴道涂片确定小鼠的动情周期，分别于动情期、动情后期和动情间期ip LPS，10小时（h）后，用RIA法测定血浆TNFα和E2、P含量的变化，RT—PCR法测定肝脏、腹腔巨噬细胞和卵巢组织中TNFα mRNA表达的变化，分析它们之间的相关关系。血浆TNFα含量于动情期（此时E2含量较高）和动情后期（此时P含量较低高）ip LPS无明显变化，于动情间期（此时E2和P含量均较低）ipLPS则明显现升高（P〈0．01）；RT—PCR结果显示，正常肝脏、腹腔巨噬细胞和卵巢组织中TNFα mRNA于动情期和动情后期表达很弱或未检测到，于动情间期表达增强；动情周期不同阶段ipLPS后，上述细胞和组织中TNFα mRNA表达均有所升高，但于动情间期升高的程度明显高于动情期和动情后期（分别P〈0．01）。动情期和动情后期由于较高水平的E2和P含量对LPS诱导的TNFα mRNA表达和TNFα含量的升高有抑制作用。     

猪瘟病毒NS3蛋白的原核表达纯化和抗体制备

以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.     

LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

分别从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中扩增ltB和hpaA基因,构建ltB-hpaA融合基因及其原核表达系统,鉴定其表达产物的免疫原性、佐剂活性及其对Hp SS1株感染小鼠的保护作用.采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增hpaA基因和ltB基因片段,构建ltB-hpaA融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列.采用质粒pQE32和宿主菌E.coli M15构建ltB-hpaA融合基因表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达.采用western blot和GM1-ELISA鉴定表达产物的抗原性、免疫反应性和佐剂活性.建立HpSS1株感染BALB/c小鼠模型,检测rLTB-HpaA的免疫保护效果.采用ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中HpaA抗体和41株Hp临床菌株HpaA表达情况.与GenBank登录的相关序列比较,所构建的ltB-hpaA融合基因核苷酸序列同源性分别为94.25%～99.71%和95.38%～99.19%.所构建的表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15的目的重组蛋白(rLTB-HpaA)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右.rLTB-HpaA能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能产生特异性抗体.GM1-ELISA结果显示rLTB-HpaA能与牛GM1结合.rH-paA免疫小鼠的保护率仅为66.7%,rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3%.81.6%患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性,所有菌株均含有HpaA.本文成功地构建了itB-hpaA融合基因高效原核表达系统,所表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性,并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用.     

无痛分娩过程中的转剖宫产指征分析

无痛分娩技术能有效缓解生产疼痛, 降低剖宫产率, 在临床得到广泛推广, 然而目前并不完全清楚无痛分娩对母婴是否足够安全, 也没有研究调查无痛分娩过程中转剖宫产指征的情况. 本文通过分析无痛分娩过程中转剖宫产的常见临床指征, 探讨无痛分娩对母婴的可能影响. 采用麦迪斯顿麻醉系统收集宁波大学医学院附属医院2018年1月至2019年3月入院进行阴道分娩的产妇的临床资料. 将进行无痛分娩产妇作为观察组, 自然分娩产妇作为对照组, 比较两组分娩过程中转剖宫产率及转剖宫产临床指征比率的异同. 在分娩过程中, 观察组(1844例)的转剖宫产率(6.29%)远远低于(P<0.0001, 2=288.75)对照组(2514例)的转剖宫产率(32.10%). 进一步分析发现, 观察组的头位难产指征比率(73.28%, n=85)、宫内感染指征比率(42.24%, n=49)以及胎儿宫内窘迫指征比率(37.07%, n=43)均显著高于(P<0.01, 2=6.68; P<0.0001, 2=36.64; P<0.0001, 2= 188.92)对照组的相应指征比率(60.84%, n=491; 3.84%, n=31; 14.37%, n=116). 与先前的报道一致, 使用无痛分娩技术的确可以显著降低产妇在分娩过程中转剖宫产的比率, 然而, 无痛分娩过程中转剖宫产的头位难产、宫内感染或胎儿宫内窘迫指征的可能性风险也显著提高.     

家猫ACE2基因克隆、测序及生物信息学分析

本研究从家猫组织中扩增并鉴定血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）基因，为阐明SARS相关冠状病毒（SARS-CoV）感染家猫的机制提供理沧依据．从家猫肺脏中提取总RNA，以Oligo dT-Adaptor为引物合成第一链cDNA，根据人及小鼠的ACE2基因mRNA序列设计系列引物，通过聚合酶链式反应，分段扩增出家猫ACE2基因的编码区的特异性片段并测序鉴定．家猫ACE2基因mRNA编码区共包括2418个核什酸，推测编码蛋白含805个氨基酸残基．其氨基酸序列与人、小鼠、大鼠ACE2氨基酸序列的同源性分别达到85％，81％和81%．利用多种生物信息学工具软件对家猫ACE2蛋白的理化及生物学性质进行分析．比较人、家猫、果子狸、小鼠、大鼠等ACE2序列中与SARS-CoV结合有关的3个功能区，发现家猫ACE2与人ACE2的同源性最高，提示家猫ACE2在SARS病毒跨种感染中可能发挥重要作用．     

经口暴露生决明子对雌性小鼠肝脏的影响

以雌性昆明小鼠为对象,分别对其灌胃蒸馏水、1和2 g·kg~(-1) BW生决明子,研究生决明子对小鼠肝功能相关指标和肝脏结构的影响,并分析内质网应激相关基因的表达水平。结果表明,连续灌胃1和2 g·kg~(-1) BW的生决明子7 d后均能激活肝细胞中内质网应激反应,引起肝脏细胞中凋亡相关基因Caspase-12、Caspase-9、Bcl-2、Bax表达上调。暴露高剂量的生决明子还会导致小鼠肝功能受损,引起肝脏炎症和淤血。     

κ-卡拉胶协同三硝基苯磺酸致鼠结肠炎症的研究

为了研究κ-卡拉胶(CGN)协同加强三硝基苯磺酸(TNBS)对BALB/c小鼠结肠炎症的作用, 利用TNBS诱导BALB/c小鼠结肠炎模型, 分析了κ-卡拉胶处理后, 小鼠存活率及组织学变化, 随后应用表达谱芯片技术分析差异表达基因. 结果发现, κ-卡拉胶增加了TNBS诱导的小鼠死亡率及结肠损伤. 芯片数据发现: κ-卡拉胶协同TNBS处理后, 较之TNBS处理组出现619个变化基因, 部分炎症相关基因继续上调, 炎症应答程度出现增强. 而κ-卡拉胶单独处理不具有致炎性, 仅影响代谢系统等相关基因的变化. 表明κ-卡拉胶可通过增强上调炎症相关基因, 加重TNBS诱导小鼠结肠炎症反应.     

鼠白细胞介素2真核表达质粒的构建及鉴定

利用小鼠IL－2基因构建真核表达质粒,筛选的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序,结果表明小鼠IL－2基因被正确地克隆支pCDNA3真核表达质粒上,将真核心质粒pCDNA2IL-2,转化大肠杆菌细胞,增菌培养后大量提取pCDNA3IL-2质粒,经紫外分光光度计检测其纯度和浓度,为加强控制害DNA疫苗的免疫功能奠定了科学的理论基础。     

紫心甘薯多糖对四氯化碳肝损伤小鼠的保护作用

研究紫心甘薯多糖对四氯化碳(CCl4)诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用及可能作用机制.以不同剂量的紫心甘薯多糖200、400、800 mg.(kg.d)-1分别给予小鼠灌胃,设立对照组,连续10 d作预处理,腹腔注射0.1%的CCl410 ml.kg-1建立CCl4诱导小鼠肝损伤模型.测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)酶活力、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)含量,测定肝组织中超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平,并进一步观察肝组织病理组织学变化.紫心甘薯多糖各剂量组均能明显地抑制血清中ALT、AST、LDH、TBIL的升高和TP的下降,降低肝脏中MDA的含量,提高肝组织中SOD和GSH活性,减轻CCl4对肝脏细胞的病理损伤.紫心甘薯多糖对CCl4致小鼠急性肝损伤具有明显保护作用,其作用机理可能与抗氧化作用有关.     

壬基酚异构体对小鼠Sertoli TM4细胞内黏着连接、雄激素结合蛋白和抑制素B的影响

研究了壬基酚异构体[4-(1-乙基-1-甲基-己基)酚](4-NP65)对小鼠睾丸Sertoli TM4细胞黏着连接相关分子表达和分泌雄激素结合蛋白(ABP),抑制素B(Inhibin B)的作用。不同浓度4-NP65(0、0.1、1、10、20、40μmol·L-1)作用于TM4细胞24h,MTT法测定细胞存活率,RT-PCR测定TM4细胞波形蛋白(Vimentin),N-钙黏着蛋白(N-cadherin),黏着斑蛋白(Vinculin)mRNA的表达情况;Elisa法测定细胞上清液中ABP和Inhibin B的含量。结果4-NP65在低剂量(0.1、1、10、20μmol·L-1)对细胞存活率无显著影响,在高剂量(40、80、100μmol·L-1)能显著降低TM4细胞存活率(P<0.01);4-NP65剂量依赖性增加Vimentin mRNA表达,降低Vinculin、N-cadherin mRNA的表达;4-NP65呈剂量依赖性降低ABP的分泌量,与对照组比较,在20、40μmol·L-1处理组有显著差异(P<0.05),而Inhibin B的含量在20、40μmol·L-1 4-NP65处理组有显著降低(P<0.05)。4-NP65对小鼠Sertoli TM4细胞具有生殖毒性作用,黏着连接是其作用的可能靶点之一,4-NP65可能通过影响TM4细胞黏着连接相关分子的表达和TM4细胞分泌ABP、Inhibin B引起雄性生殖系统损伤。     

大蒜活性物质对高血脂小鼠肝细胞的影响

目的通过大蒜素和蒜氨酸+蒜氨酸酶混合物处理高血脂小鼠,比较了它们对高血脂小鼠体重、肝重、肝脏细胞形态和脂肪变性的影响.方法大蒜素与蒜氨酸+蒜氨酸酶混合物处理高血脂小鼠,8周后称量小鼠体重和肝重.制作小鼠肝脏细胞石蜡切片和冰冻切片观察的细胞形态.结果大蒜活性物质大蒜素与蒜氨酸+蒜氨酸酶混合物能抑制高血脂小鼠体重和肝重的增加,降低肝系数,并且具有剂量依赖性.组织学观察表明高剂量大蒜素与蒜氨酸+蒜氨酸酶混合物均能减轻脂质对肝细胞形态的改变.与高血脂模型组相比,高剂量大蒜素与蒜氨酸+蒜氨酸酶混合物处理组肝索排列呈放射状,肝细胞排列较为紧密、规则,细胞核位置接近中央,有细胞界限.细胞内颗粒、脂滴和炎性细胞浸润和肝细胞坏死较少.结论大蒜素和蒜氨酸+蒜氨酸酶混合物能减轻高血脂小鼠脂肪对肝细胞的浸润和脂肪变性,并减轻脂肪对肝小叶和细胞形态的改变.蒜氨酸+蒜氨酸酶混合物在降低高血脂小鼠体重和肝重的效果优于大蒜素.     

芜菁拮抗交通性污染物致小鼠遗传毒性效应的初步研究

以清洁级ICR小白鼠为实验动物,选择温州市鹿城区十里亭、火车站、南站交通岗亭为处理现场,采用小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)的微核试验、小鼠精子畸形试验以及分光光度法测定小鼠肝脏过氧化氢酶(CAT)活性等实验方法,研究温州市区交通污染物对小鼠的遗传毒性及芜菁块根汁对它的拮抗效应.结果表明:经交通污染物处理的小鼠,其PCE的微核率、精子畸形率以及肝脏过氧化氢酶活性均明显高于阴性对照组;灌芜菁块根汁均可使小鼠PCE微核率、精子畸形率以及CAT活性明显下降,微核抑制率分别为62.96%、80.18%、87.36%,精子畸形抑制率分别为21.88%、45.89%、40.65%,CAT活性抑制率分别为17.27%、31.36%、37.76%.结论是交通性污染物对小鼠具有明显的遗传毒性效应;芜菁块根汁对交通性污染物引起小鼠遗传毒性效应具有显著的拮抗效应.     

乳酸菌源纳米硒对小鼠生长与繁殖性能影响

硒是重要的微量元素,纳米硒具有更好的生物学功能,且毒性显著低于无机硒。通过对昆明系小鼠灌胃不同浓度乳酸菌源纳米硒进行试验:对照组,0.2mg·kg-1纳米硒组,0.5mg·kg-1纳米硒组,1.0mg·kg-1纳米硒组,研究分析此纳米硒对小鼠生长与繁殖性能的影响。纳米硒添加水平在0.5mg·kg-1时,对小鼠促生长与繁殖性能效果最明显,此时小鼠日增重提高了24.88%(P<0.01),料重比降低了23.34%(P<0.01),小鼠的平均产仔率提高了40.00%,产仔窝数比对照组提高了40.00%,同时平均每窝产仔数也提高了11.44%;结合纳米硒使小鼠全血、睾丸中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活力分别提高了19.27%(P<0.01)、90.68%(P<0.01)的影响以及GSH-PX在动物繁殖性能方面的重要性,可以推断该乳酸菌源纳米硒能够明显提高小鼠的生长与繁殖性能。更多还原     

牛磺酸对缺血/再灌注大鼠肾脏GRP78和Caspase-12表达的影响

观察牛磺酸(Tau)对肾缺血/再灌注(I/R)大鼠肾脏GRP78、Caspase-12表达的影响及其意义。将Wistar大鼠30只随机分为假手术组(对照组)、I/R组和I/R+TMP组。采用夹闭双侧肾蒂45min再灌注24h制备肾I/R模型。I/R+TMP组在手术前1h按200mg.kg-1腹腔注射Tau,余操作同I/R组。检测血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr);光镜观察肾小管组织结构变化;RT-PCR和免疫组化检测GRP78、Caspase-12mRNA和蛋白表达。与假手术组比较,I/R组大鼠血清BUN,Cr水平显著升高,肾组织损伤严重,GRP78和Caspase-12mRNA和蛋白表达呈显著性增加(P<0.01);与I/R组比较,I/R+Tau组血清BUN、Cr水平及GRP78、Caspase-12表达均有显著性下降(P<0.05),肾脏损伤明显减轻。牛磺酸对肾脏缺血/再灌注大鼠GRP78、Caspase-12过度表达升高有很好的抑制作用,这可能是它减轻肾脏缺血/再灌注损伤的重要机制之一。     

转谷氨酰胺酶催化的花生过敏原Ara h 2交联反应位点分析

酶催化交联是蛋白质改性的常用加工手段,交联方式和交联位点不同,对蛋白质性质的影响也不同。采用转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,MTG)催化Ara h 2发生交联反应。通过液相-质谱联用对交联后的蛋白产物进行分析,再利用StavroX软件分析质谱数据,寻找不同反应条件下,蛋白质交联反应的发生位点。结果显示,在MTG的催化下,K142、K52均参与交联反应。还原后的Ara h 2的交联反应较未还原蛋白更为活跃,未还原蛋白中仅发现3对分子内交联肽段,而还原后的蛋白中找到16对交联肽段(既包括分子内交联也包括分子间交联),但还原蛋白中仅K142参与了分子内交联反应。研究揭示的Ara h 2交联方式和交联位点,为交联反应对蛋白质改性机制研究奠定了基础。更多还原     

石蒜碱对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及机制

建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,以10、14、20、28、40 mg/kg 5个剂量组给药,探讨石蒜碱的抑瘤作用及机制,采用HE染色法观察肿瘤细胞的形态学变化,通过免疫组化实验观察石蒜碱对瘤体细胞凋亡相关因子Fas-L、Caspase-9、Bax、Bcl-2表达的影响。石蒜碱对Lewis肺癌小鼠的抑瘤率随着剂量的增加而增大,高剂量组(40 mg/kg)石蒜碱对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用最明显,抑瘤率达56. 8%(p0. 01);HE染色结果显示高剂量组(40 mg/kg)小鼠瘤组织细胞间隙增大,细胞数目明显减少;免疫组化实验结果表明石蒜碱可通过上调促凋亡蛋白Fas-L、Caspase-9、Bax,下调抑凋亡蛋白Bcl-2,促进肺癌Lewis细胞凋亡。     

严重烧伤诱导大鼠心肌细胞内质网应激反应

观察严重烧伤大鼠心肌细胞内质网应激蛋白表达的改变及其意义,以探讨严重烧伤后心肌损伤与内质网应激的关系.将大鼠脱毛后于92 ℃水烫18 s,造成30%Ⅲ度烫伤(烧伤组)模型;牛磺酸治疗组大鼠在烫伤后即刻腹腔注射2%牛磺酸液(200mg/kg体重),其它操作与烧伤组相同.烧伤组和牛磺酸治疗组均于伤后1、3、6、12和24 h检测.对照组于37 ℃水浴18 s,1 h后进行检测有关指标.结果显示烧伤组大鼠伤后3h血浆中cTnT含量即呈显著升高(P＜0.01),心肌中GRP94 mRNA和蛋白表达于烧伤后3 h显著性升高,12 h达峰值,24 h还呈显著升高;伤后12 h心肌细胞Caspase-12 mRNA表达明显高于对照组;牛磺酸治疗组GRP94的表达和Caspase-12 mRNA表达量较烧伤组均有显著性降低(P＜0.05).结果表明严重烧伤可诱导心肌细胞内质网应激.     

纳米二氧化硅体内与体外氧化应激及细胞毒性实验研究

研究了纳米二氧化硅(SiO2)体内及体外氧化应激损伤及细胞毒性作用及机制.体内实验采用ICR小鼠,纳米SiO2经口灌胃染毒3次,检测肺组织中MDA(丙二醛)和SOD(超氧化物歧化酶)含量,观察纳米SiO2对小鼠肺的氧化应激毒性.采用体外培养的小鼠上皮细胞(JB6细胞),观察不同质量浓度纳米SiO2染毒后的细胞形态改变,通过蛋白免疫印迹实验检测纳米SiO2是否通过FAS信号途径引起细胞凋亡.研究结果表明:纳米SiO2经口染毒后对小鼠肺具有氧化应激损伤作用,表现为随染毒剂量的升高,肺组织中MDA产生量增加,呈一定的剂量-反应关系.同时,肺组织内SOD水平总体趋势降低,但是差别未见统计学意义.体外培养细胞实验中,纳米SiO2染毒后可引起细胞出现凋亡并呈空泡样变.蛋白免疫印迹实验中,纳米SiO2可引起FAS信号蛋白表达量明显上升,但是FADD表达水平并不升高.