聚合酶链式反应微流控芯片的准分子激光制备和应用研究

摘要采用价格便宜的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)代替价格昂贵的硅或玻璃作为聚合酶链式反应(PCR)微流控芯片的基片材料,采用柔性大且自动化程度高的准分子激光微加工方法代替加工工艺复杂的光刻化学腐蚀方法,在19 kV和18 mm/min的优化加工参数下,在48 mm×67 mm×1 mm的PMMA基片上制备出20个循环的PCR微流控芯片. 芯片微通道横截面呈梯形,底面光滑. 微通道宽104 μm,深56 μm,长2 060 mm,加工耗时约110 min. 该芯片和相同尺寸的盖片在160 N和105 ℃条件下通过热压经20 min键合在一起,键合强度为0.85 MPa. 键合后的芯片和温控系统集成在一起,采用比例积分微分(PID)方法得到的控温精度为±0.2 ℃,采用红外热像仪得到的相邻温区间的温度梯度分别为16.5和22.2 ℃,最后利用该芯片在对170 bp的DNA片段实现了体外扩增.     

液滴微流控系统在数字聚合酶链式反应中的应用研究进展

数字聚合酶链式反应( PCR)技术近年来发展迅速。与以实时荧光定量PCR为代表的传统PCR技术相比,数字PCR技术显著提高了定量分析的精确度和灵敏度。数字PCR的快速发展与近年来微流控技术在数字PCR技术中的广泛应用有着密切的联系。早期的研究和商业化产品使用的是大规模集成流路微流控芯片,加工过程复杂且价格高昂。近年来,液滴微流控芯片被应用到数字PCR技术中,它可以在短时间内产生102~107个微液滴,每一个微液滴都是最多只含有一个目的基因片段的PCR反应器。 PCR扩增后,通过对单个微液滴的观察计数,就可以获得绝对定量的分析数据。本文综述了不同种类的液滴微流控系统在数字PCR技术中的应用,以及液滴数字PCR微流控芯片在生物、医药、环境等领域的应用。     

微流控PCR芯片的研究进展

基因是人类的遗传密码,人类个体之间只有万分之一的基因不相同,却导致了人与人之间丰富的差异.了解这种差异对于科学研究具有巨大的应用价值.PCR是基因研究中常用的手段之一,但传统PCR仪存在反应时间长、能量消耗大、不便于集成与携带等缺陷,微流控技术与PCR结合可以有效缩小反应体系,提高反应效率,且易于集成化与微型化.本文按照微流控PCR芯片的结构分类,详细介绍了微池型、连续流动型PCR芯片,以及电泳、荧光、电化学和DNA杂交阵列等检测方法,并在最后进行了总结与展望.     

数字聚合酶链式反应技术及其在疾病检测中的研究进展

数字聚合酶链式反应（Digital polymerase chain reaction, d PCR）技术是通过将反应体系均分到数万个独立的PCR反应单元进行单分子级扩增,并结合泊松分布实现单拷贝核酸分子精确定量分析的PCR技术。dPCR技术具有灵敏度高、无需标准曲线等优势,被广泛应用于疾病检测领域。随着阶梯乳化和三维成像等技术的引入,dPCR技术在检测精度、多重检测和检测速度等方面得到极大改进,显著提升了其临床疾病诊断性能。本文追溯了dPCR技术的发展历程,对其在肿瘤和感染等疾病检测中的应用进行了综述,分析了dPCR技术发展存在的挑战与机遇,以期为dPCR技术未来的开发利用提供参考,推动临床检验分子技术高质量发展。     

连续流动式聚合酶链式反应微流控装置的实验研究

连续流动式聚合酶链式反应(PCR)微流控装置是以低热容量的软薄膜加热器为基础构建3个恒温带,以聚四氟乙烯毛细管微通道为PCR反应体系组建而成。报道了在毛细管微通道中小牛血清蛋白(BSA)动力学表面钝化对PCR扩增的影响,讨论了PCR混合物在毛细管微通道中的流动速度对PCR扩增的影响,在15 m in甚至10 m in内成功扩增了长度为249 bp的人类β-肌动蛋白片断,扩增时间仅10~15 m in,而传统PCR仪则需1~2 h。     

微流控技术在纳米合成中的应用

微流控技术具有微型化、集成化的特点,且所合成产物形貌和单分散性好,已经越来越多的被应用于纳米材料的合成中。 本文对微流体技术在纳米材料合成中的应用做了系统的阐述。 对微流控芯片中流体流动、混合机理进行了介绍,并详细介绍了微流控芯片的制作工艺,展望了微流体技术在合成纳米材料中应用前景。     

微流控振荡流反转录聚合酶链式反应快速检测烟草花叶病毒

建立了一种基于毛细管的振荡流反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的微流控装置检测烟草花叶病毒(TMV)的新方法.根据TMV移动蛋白基因设计一对PCR引物,对粗提纯TMV颗粒直接进行RT-PCR.用0.025%小牛血清蛋白(BSA)对反应毛细管内壁进行静力学和动力学钝化,提高了PCR效率.在此微流控装置上进行RT-PCR,流速为70 μL/min时, 检出限为0.01 μg cDNA;可以在17 min内成功扩增出179 bp的目的DNA片段.     

一种用于核酸高灵敏检测的液滴式数字聚合酶链式反应芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,构建了一种新型的液滴式数字聚合酶链式反应(dd PCR)芯片.该芯片由产生液滴的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块和储存液滴的玻璃腔室构成.实验结果表明,该芯片可以在25 min内产生2×106个直径为20μm的微液滴(体积4.187 p L).利用该芯片定量检测了表皮生长因子受体(EGFR)基因第19号外显子,在DNA浓度为106~101copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9998);在浓度为106copies/μL的19号外显子野生型DNA中检测105~100copies/μL的突变型DNA,其检测敏感度可达到0.0001%.该方法在同一芯片上实现了液滴产生、核酸扩增和荧光信号读取的功能,在核酸绝对定量及痕量突变基因的检测中具有潜在应用前景.     

连续流动式聚合酶链式反应芯片的设计进展

介绍了PCR的概念以及微型PCR芯片的优点，着重介绍连续流动式PCR(continuous-flow PCR)芯片／微装置的一般原理、串行流动及其设计进展。     

一种用于核酸绝对定量检测的高鲁棒性液滴式数字PCR芯片

为满足液滴式数字聚合酶链式反应(PCR)技术对扩增反应过程中稳定保存液滴以及反应后高效检测的核心需求,构建了一种具有过滤气泡和增强荧光信号功能的液滴式数字聚合酶链式反应芯片.该芯片可在10 min内产生20多万个半径约为21μm的液滴.利用"玻璃天花板"的方式构建了独立于芯片主体材料的液滴收集腔,为液滴提供稳定的保存与反应环境;还构建了过滤结构,可有效过滤混入液相中的空气,提高芯片鲁棒性.同时,在液滴收集腔中引入反射层,增强荧光信号,使单个视野荧光成像时间缩短约40%,提高了检测效率.利用该芯片定量检测EGFR基因第21号外显子,检测信号与DNA浓度在10¹～10⁵copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R²=0.998).该方案在载玻片大小的芯片上实现了液滴产生、PCR扩增和荧光信号读取,并具有较高的鲁棒性与检测效率,在核酸检测等方面具有应用潜力.     

一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片

构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应(数字PCR)微流控芯片. 应用多层软光刻技术, 以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料, 盖玻片作为基底制作了具有3层结构以及微阀控制功能的微流控芯片. 芯片的大小与载玻片相当, 可同时检测4个样品, 每个样品通入芯片后平均分配到640个反应小室, 每个小室的体积为6 nL. 以从肺癌细胞A549中提取的18sRNA为样品检测了该芯片的可行性. 将样品稀释数倍后通入芯片, 核酸分子随机分布在640个小室中并扩增. 核酸分子在芯片中的分布符合泊松分布原理, 当样品中待测核酸分子平均拷贝数低于0.5个/小室时, 则每个反应小室包含0个或1个分子. 经过PCR扩增后, 有模板分子的小室检测结果为阳性反应, 而无模板分子的小室为阴性反应, 最后通过计数阳性反应室的个数, 可绝对定量原始待测样品中的目标DNA分子拷贝数. 实验结果表明, 该数字 PCR芯片可实现DNA单分子反应和核酸绝对定量, 具有成本低、 灵敏度高、 节省时间和试剂以及操作简单等优点, 为数字PCR方法在普通实验室的应用提供了一种新途径, 可用于癌症及感染性疾病的早期诊断、 单细胞分析、 产前诊断以及各种细菌病毒的核酸检验等研究.     

多重聚合酶链反应-毛细管电泳-激光诱导荧光法检测三种食源性致病菌

建立了食品中常见致病菌大肠杆菌O157:H7的uidA基因、沙门菌的invA基因和志贺菌的ipaH基因的多重聚合酶链反应（PCR）产物的毛细管电泳快速检测方法。根据这3种致病菌的特异性基因序列设计多重PCR引物,优化PCR扩增反应体系,采用7.0 g/L 甲基纤维素为筛分介质,毛细管电泳-激光诱导荧光检测法同时检测了3种常见致病菌的PCR扩增产物。在优化的多重PCR反应和毛细管筛分电泳条件下,该方法可以同时检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157:H7基因的多重PCR扩增产物,22 min内即可完成3种常见致病菌的毛细管电泳检测。迁移时间的相对标准偏差为1.47%~2.07%。与凝胶电泳法比较,该法简便快速,灵敏度高,可用于多种致病菌脱氧核糖核酸的检测,为食品安全提供了一种可靠的快速检测方法。     

PCR生物微流体芯片中的表面钝化技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是一种重要的体外DNA扩增技术,在生物化学、分析化学以及分子生物学等领域中得到广泛的应用．基于微电子机械系统（Microelectromechanical system,MEMS）技术构建而成的PCR生物微流体芯片由于具有反应速度快、样品消耗少以及所占空间体积少等优点而倍受人们亲睐．然而,伴随之较大比表面积以及其所用的裸露衬底材料常常抑制PCR反应,从而导致PCR不能顺利进行．本文结合本试验室的研究工作,综述了PCR生物微流体芯片中为了获得“友善”的PCR扩增体系而采取的表面钝化技术,主要包括表面钝化的必要性、静力学／动力学表面钝化技术以及硅相关材料对PCR抑制的机制等等．     

毛细管电泳柱及微流控芯片通道涂层的发展

综述了用于毛细管电泳柱和微流控芯片通道的涂层材料和涂层技术的发展状况,以及涂层对分离效果和分离结果重现性的影响。将涂层材料按照动态和静态分类,静态涂层又分别按照均聚物、共聚物、杂环类等进行讨论;综述了交联反应法、溶胶-凝胶法、辐照法、化学沉积法等涂层的制备方法。对毛细管电泳柱和微流控芯片通道的改良具有一定的参考价值。     

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统将核酸提取、PCR扩增与实时荧光检测进行整合,在同一块微流控芯片上实现了核酸分析过程的全自动和全封闭,具有试剂用量少、分析速度快、操作简便等优点。本研究采用微机械加工技术制作集成核酸提取微流控芯片的阳极模,使用组合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片,与玻璃基底通过等离子体键合封装成集成核酸提取芯片。构建了由微流体速度可调节(0~10 mL/min)的驱动控制装置、温控精度可达0.1℃的TEC温控平台、CCD检测功能模块等组成的微全分析系统。以人类血液裂解液为样品,采用硅胶膜进行芯片上核酸提取。系统根据设置好的时序自动执行,以2 mL/min的流体驱动速度完成20μL裂解液上样、清洗;以1 mL/min的流体驱动速度完成DNA洗脱,抽取PCR试剂与之混合注入到反应腔。提取的基因组DNA以链上内参基因GAPDH为检测对象,并以传统手工提取为对照,在该系统平台上进行PCR扩增和熔解曲线分析实验。片上PCR扩增结果显示,扩增曲线明显,Ct值分别为25.3和26.9。扩增产物进行熔解曲线分析得到的熔解温度一致,均为89.9℃。结果表明,此系统能够自动化、全封闭的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR扩增与实时定量分析。     

微流控芯片-激光诱导荧光快速检测4种食源性致病菌

建立了食品中4种常见食源性致病菌的微流控芯片快速检测方法。根据副溶血弧菌的Vpara(16S-23S rDNA IGS)基因、沙门菌的invA基因、大肠杆菌O157:H7的rfbO157基因和志贺菌的ipaH基因序列设计了4对特异性引物,对上述致病菌进行四重PCR扩增,采用微流控芯片-激光诱导荧光检测食品中4种常见致病菌的多重PCR扩增产物。优化了多重PCR扩增和微流控芯片电泳分离的实验条件。当芯片电泳的筛分介质HPMC-50浓度为2.2%、溴乙锭(EB)含量为3.75μmol/L、电场强度为120 V/cm时,pUC Mix DNAMarker-8和待测致病菌的多重PCR扩增产物可以实现基线分离,600 s内即可完成上述4种致病菌的同时检测,迁移时间的日内相对标准偏差为0.74%~2.09%。本方法能够检出1×102cfu/mL的副溶血弧菌、沙门菌、大肠杆菌O157:H7和志贺菌。方法特异性高,所设计的引物在10种非目的菌株体系中均未见扩增的片段。将本法应用于食品中上述致病菌的测定,获得了满意的结果,为常见食源性致病菌的快速检测提供了一种新的可靠分析手段,对保障食品安全具有重要的现实意义。     

玻璃基质微流控芯片用于DNA片段的分离和C677T基因突变的快速检测

基于微加工方法,在一般实验条件下,成功地制备了玻璃芯片。利用水溶性聚合物对玻璃通道进行动态修饰,从而抑制了DNA分子的吸附作用,并成功地用于DNA片段的分离和四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)中C677T的突变检测。