固定化酶反应器在高效液相色谱分析中的应用

高效液相色谱法(HPLC)是分离含多组分的复杂体系的最有效手段之一,但检测体系的灵敏度总不能令人满意。折光率检测器通用,但灵敏度不高;紫外、荧光、电化学检测器要求化合物须有生色团、荧光团和电活性基团。近年来,柱前和柱后标记方法发展较快,扩大了这些检测器的应用范围。在标记方     

采用磁性载体制备的固定化酶反应器的载体粒径对蛋白质酶解性能的影响

研究了以不同粒径的磁性颗粒为载体的固定化酶反应器在蛋白质酶解过程中,其粒径大小对团聚、酶解效率和漏切位点等的影响。实验结果表明,纳米级颗粒的酶负载量为亚微米级的3.5倍左右。但当酶固定量相同时,酶解效率基本相当。而在一定程度上加大磁性颗粒的粒径后,团聚现象得到明显改善。选择磁性载体粒径为20 nm的固定化酶反应器,对其性能进一步考察。结果显示胰蛋白酶与牛血清白蛋白(BSA)的质量比为1:1时,即能于1 min内实现快速酶解;当酶解10 min时,其零漏切位点肽段数和蛋白质序列覆盖率基本达到稳定,并明显优于溶液酶解水平。通过对漏切位点的统计分析比较,发现固定化酶解与溶液酶解时的漏切位点规律基本类似。因此,采用不同粒径磁性载体制备的固定化酶反应器均可在蛋白质组学研究中提供快速、高效的酶解。     

整体固定化酶反应器的研制

制作了微型整体柱型的固定化酶反应器。在500μm内径毛细管内,以乙烯基三甲氧基硅烷处理形成端基烯键,采用原位合成法,以甲基丙烯酸2-羟乙酯为功能单体,以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂制备了整体柱。整体柱表面的羟基经NaIO4氧化形成醛基后与胰蛋白酶的氨基进一步反应,实现胰蛋白酶的固定。在24s内,该酶反应器实现了肌红蛋白和细胞色素c的酶解,经MALDI-TOF MS鉴定,序列覆盖率分别达到65%和79%。     

固定化多酶级联反应器

多酶级联反应在生命活动过程中发挥着重要作用。固定化多酶级联反应器是将不同功能的酶通过物理化学或生物手段固定于特定载体上,以之模拟生物体内多种酶协同作用方式促使底物发生降解和转化等反应的新型仿生催化技术。该技术具有固定化酶的稳定性、可重复利用以及酶级联的高效协同催化等优点,近年来在生物传感、模拟生物学以及生物转化等领域得到越来越多的关注。本文从多酶级联反应原理、反应器制备、级联反应的影响因素及应用等方面对近年来固定化多酶级联反应器的进展进行详细评述,并展望其发展前景。     

原子转移自由基聚合修饰银丝固定化酶反应器的制备及在蛋白质组鉴定中的应用

针对传统溶液酶解存在的酶解时间较长、酶自切物干扰以及蛋白酶不能重复使用等缺陷,通过电子转移生成催化剂的原子转移自由基聚合法修饰银丝,并以其为载体制备了一种新型的固定化酶反应器。用质谱考察了银丝固定化酶反应器(SW-Trypsin)的酶解效率、重复性和回收率。结果表明:绒毛状聚合物修饰的SW-Trypsin的酶解效率较高,酶解标准蛋白牛血清白蛋白(BSA)20 min后,肽段的氨基酸序列覆盖率可达93%,高于传统溶液酶解方法酶解16 h所得79%的覆盖率。使用该固定化酶反应器于一个月内8次酶解BSA所得的氨基酸序列覆盖率在89%到97%之间,平均覆盖率为94%,显示出良好的稳定性。另外,该固定化酶反应器酶解马心肌红蛋白(MYO)的回收率为87.67%。最后,用SW-Trypsin酶解腾冲嗜热菌全蛋白20 min,所鉴定到的氨基酸序列覆盖率和蛋白数量与同样条件下溶液酶解16 h的结果接近,且零漏切位点肽段的比例更高。加之容易分离的优点,SW-Trypsin在蛋白质组学的应用中具有良好的前景。     

蛋白质组学中的固定化酶反应器制备的研究进展

固定化酶反应器作为蛋白质组学研究中"bottom-up"策略重要的组件,具有酶解快速、酶解效率高、酶稳定性和活性高、简单易操作、能够与多种检测方式联用等优点,对于发展高效快速的蛋白质组学分析方法具有重要意义。本文就固定化酶反应器的制备方法及其在蛋白质组学中的应用做简单的概述,着重介绍酶的固定方法、固定化酶的载体、用于固定的酶的种类。近几年固定化酶反应器的研究集中于提高固酶量、保持酶活性、增加酶解效率、减小非特异性吸附等方面。研究结果表明,采用纳米材料、整体材料等新型载体,提高载体亲水性,采用多酶同时酶解等方法能够有效改善固定化酶反应器的性能,提高蛋白质的鉴定效率。     

基于DNA定向固定化技术构建毛细管固定化酶微反应器的研究进展

生物酶影响着物质代谢和质能转换等生命活动,生物体内某些酶的活性变化会导致疾病的发生。发展新型的酶分析方法对深刻理解生物代谢过程、疾病诊断和药物研发等具有重要意义。毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快、操作简单和样品消耗少以及可与多种检测手段联用等优点,在酶分析研究中越来越受到关注。CE酶分析主要包括离线和在线两种模式,其中,固定化酶微反应器与毛细管电泳联用(CE-IMER)的在线酶分析已经成为主要的酶分析方法之一。CE-IMER充分结合了固定化酶和CE的优势,将游离酶固定在毛细管内,不仅可以显著提高酶的稳定性和重复使用性,而且可以实现纳升规模溶液的自动化酶分析,进而显著降低酶分析成本。目前已有大量方法制备IMER用于CE酶分析,然而如何构建性能良好、可再生使用、酶固载量大、自动化程度高的CE-IMER一直是该领域重点研究的问题。DNA定向固定化技术(DDI)可以充分利用DNA分子的碱基互补配对(A-T, C-G),在温和的生理条件下特异性固定生物大分子。由于短链双螺旋DNA分子具有较强的机械刚性和物理化学稳定性,通过DDI将酶固定在载体表面,有利于降低传质阻力,提高酶与底物的接...     

酶的固定化及其应用

酶的固定化研究始于1960年代中期,从1970年代初开始酶的固定化技术研究发展很快,至1980年代初,每年约发表1000篇以上的文献和近200篇专利,所报道的固定化方法达100种以上[1].1980年代中以后,酶和细胞固定化研究的发展速度开始减慢,从而有人认为,对酶的固定化技术应予以重新评价     

固定化酶纳升微反应器用于痕量蛋白质快速肽谱分析的研究

利用毛细管作为酶固定化的载体,将酶直接键合到毛细管内壁,制成毛细管纳升反应器,结合质谱分析水解产物,获得了蛋白质的肽谱.实验发现,以毛细管为反应器后,蛋白质肽谱分析所需量大大减少,只需10^-13mol,甚至几个10^-15mol的量就可满足分析要求.     

集成化蛋白质组定量分析平台的构建及应用

为提高蛋白质组定量分析的准确度、通量和自动化程度,构建了由微升级混合离子交换色谱、亲水型固定化酶反应器（hIMER）和纳升级反相色谱-电喷雾串级质谱（nanoRPLC-ESI-MS/MS）组成的集成化蛋白质定量分析平台。该平台实现了二甲基化标记蛋白质样品在线分离、酶解、肽段分离鉴定和定量分析。采用质量比为1：1的轻、重标记的蛋白质样品考察该平台的定量性能,发现蛋白质水平二甲基化标记效率为90%;蛋白质经hIMER在线酶解10 min产生的漏切及酶解产物在hIMER柱上的非特异性吸附对定量准确度的影响较小,所有定量到的重/轻标记的蛋白质质量比的平均值为1.01。最后将该平台应用于小鼠腹水型肝癌淋巴道高、低转移细胞系差异蛋白质的分析,发现了12种蛋白质在高转移细胞系中低表达,15种蛋白质在高转移细胞系中高表达。以上结果证明了该平台可以实现高准确度和高通量的蛋白质组定量分析。     

多层开管毛细管酶反应器的制备及在蛋白质酶切中的应用

以石英毛细管作为酶固定化的载体, 在毛细管内壁上逐步合成树枝形大分子聚酰胺-胺(PAMAM), 再通过交联剂戊二醛将胰蛋白酶直接键合到该大分子的末端氨基上, 并对酶固定化条件进行了优化, 制备了多层酶反应器. 利用该酶反应器对马心细胞色素C等蛋白质进行了酶切, 并对酶切的条件进行了优化. 实验结果表明, 该固定化酶反应器具有较高的酶切效率、良好的重现性和稳定性, 可用于蛋白质组学的研究.     

高效液相色谱中固定酶柱后反应器的应用

本文评述了固定酶柱后反应器在高效液相色谱中的应用。阐述了高效液相色谱与固定酶柱后反应器联用的原理,介绍了固定酶柱后反应器的主要类型。评述了固定酶柱后反应器在生化分析和临床分析中的应用。引文43篇。     

基于多级孔金属有机骨架构筑HRP固定化酶反应器及其染料降解应用

以不稳定的Cu-金属有机骨架(Cu-MOF)为模板剂, 利用自组装模板法制备多级孔Zr-MOF, 再通过物理吸附法在多级孔Zr-MOF的介孔孔道中负载辣根过氧化物酶(HRP)构筑了HRP@Zr-MOF固定化酶反应器. 通过改变孔径调节剂苯甲酸(HBC)的浓度调控孔径大小, 研究了孔径对固定化酶反应器催化活性的影响; 考察了固定化体系缓冲溶液pH值、 固定化时间及温度对固定效果的影响. 以HRP催化降解结晶紫染料为模型反应, 探讨了HRP@Zr-MOF的操作稳定性和重复使用性. 结果表明, pH=3.0、 固定化时间为60 min、 固定化温度为30 ℃是固定化HRP的最佳条件, 固载量最高可达61.6 mg/g. 与游离酶相比, HRP@Zr-MOF固定化酶反应器表现出更好的热稳定性、 酸碱稳定性、 H₂O₂稳定性和储存稳定性; 重复使用10次后, HRP@Zr-MOF的催化活性仍能保持62.3%. 将HRP@Zr-MOF应用于实际水样中结晶紫染料的催化降解, 在5 min内降解率高达90%以上, 表现出非常高效的催化效率.     

Lab‐on‐a‐Chip Biosensor for Glucose Based on a Packed Immobilized Enzyme Reactor

In this work, the development of a packed immobilized enzyme reactor (IMER) and its integration to a capillary electrophoresis microchip is described. The present microchip design differs from others, in the fact that the same design could be used with or without the particles and, just by changing the material used to pack the IMER, different analytes can be detected. The applied procedure involves the separation of the target analyte by capillary electrophoresis (CE), which is then coupled to a post‐column IMER that produces H₂O₂. The H₂O₂ produced is finally detected downstream at the surface of a working electrode. Glucose was detected above 100 μM by packing particles modified with glucose oxidase at the end of the separation channel. The analytical performance of the microchip‐CE has been demonstrated by performing the separation and detection of glucose and noradrenaline. Additions of fructose showed no effect on either the peak position or the peak magnitude of glucose. The microchip‐CE‐IMER was also used to quantify glucose in carbonated beverages with good agreement with other reports.     

基于温敏型材料的固定化酶的制备及其在蛋白质组快速分析中的应用

蛋白质组学通过规模化鉴定、分析从细胞、组织或有机体中提取的蛋白质,从而获得蛋白表达、修饰、组成和定量的变化信息。在目前最为有效的“鸟枪法”蛋白质组学策略中,固定化酶试剂基质常用固相载体材料,该固定化酶试剂在酶解蛋白质时为异相体系,存在固液界面传质阻力和空间位阻,限制了酶解效率和样品处理通量。针对这一技术瓶颈,本研究利用温敏聚合物对外界温度变化的响应能力,制备了一种新型的基于可溶性温敏聚合物的固定化胰蛋白酶试剂。该固定化酶特有的温度敏感特性,使其具有“高温均相酶解,低温异相分离”的特色,且兼具酶切时间显著缩短、酶可重复利用的优势。 BSA 1 min固定化酶解产物肽段的氨基酸序列覆盖率可达94%,高于传统溶液酶解12 h所得覆盖率为(74%)。进一步将该固定化酶试剂应用于HeLa细胞全蛋白质组的酶解,其酶解效果与相同条件下溶液酶解12 h相当。该固定化酶试剂对复杂蛋白质的快速、高效酶解充分证明其在蛋白质组学研究中的应用潜力。     

固定化谷氨酸脱羧酶柱式反应器测定L-谷氨酸

用羧甲基化的N,N’-甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基葡聚糖(简称CM-CADB)凝胶树脂为新型载体,研究了谷氨酸脱羧酶(GDC)在CM-CADB上的固定化与环境的依赖关系.确定了酶固定化最佳条件,研究了固定化GDC的活性与底物浓度、pH、温度的依存性,动态响应特性,热稳定性和寿命,求算了米氏常数.将固定化GDC酶柱与进样系统具CO_2气敏电极的离子活度分析器-计算机数据采集系统匹配,构成酶反应谷氨酸检测装置,测定了固定化GDC酶柱的能斯特线性响应曲线,线性回归方程为y=43.3x+181.6,r为0.9936.     

漆树酶固定化及其性质研究

本文介绍了用过渡金属水合氧化物固定化漆树漆酶的方法。考察了整合法固定漆树酶的最适条件。对固定化前后漆酶的性质进行了比较,并分析了造成固定化酶与游离酶性质差异的原因。     

溶解性可调节的酶载体制备和固定化酶的研究

本文利用自由基沉淀聚合反应,合成了甲基丙烯酸-丙烯酰胺-顺丁烯二酸酐三元共聚物,测定了这些共聚物形成水不溶性的大分子氢键复合物的临界pH值.利用共聚物上的酸酐基团,直接进行了木瓜蛋白酶的固定化,得到了具有液相酶与固相酶两者优点的新型修饰酶。     

固载化酶催化合成多肽的研究进展

评述了溶剂、载体性质与固载化方法、pH值、底物浓度以及反应温度等因素对固载化酶催化合成肽反应的影响,并概括了固载化酶催化合成生物活性肽、寡肽等方面的研究与应用.