高效抗虫转基因烟草的研究

苏云金杆菌HD-1的杀虫蛋白基因经5′端改造,3′端进行4种不同长度缺失后插入到含有双增强子的35S启动子,翻译增强子“Ω′”片段的双元载体中,借助土壤农杆菌LBA 4404将在此双元载体上的杀虫蛋白基因及新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)转入到生产品种烟草NC89的染色体上,从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用1—3龄烟青虫对这些转化植株进行大量重复虫试结果表明用4种不同长度B.t.基因转化的再生植株中都有抗虫性高的植株,其中以1.8kb的B.t.Cry IA(c)基因转化的植株杀虫效果最好,这一组转基因植株的平均杀虫率在90—100％的约占该组总虫试植株的50％。对高抗虫性植株的子一代(T1)和子二代(T2)进行遗传分析,分子生物学分析和进一步的抗虫试验表明B.t.基因已遗传到子代并初步选到了高抗虫性的转基因纯合株系D8-14和D19-8等。     

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因导入棉花获得转基因植株

苏云金芽孢杆菌的两个变种中B.t.aizawai 7-29和B.t.kurstaki HD-1是毒杀棉铃虫、红铃虫等鳞翅目害虫的优良菌株.本文通过花粉管途径将B.t.aizawai 7-29和 B.t.kurstaki HD-1的杀虫基因分别导入我国棉花品种(无毒棉、中棉12, 3118,3414)中,经Dot blotting证明,有3株棉花(A1,A2, A5)带有B.t.aizawai 7-29的杀虫基因,18株棉花(B1-4,B6, B7,B9-15,B17—21)带有B.t.kurstaki HD-1的杀虫基因.取2株点杂交呈阳性的植株(A1,A2,)进行Southern blotting,结果表明,A1和A2植物DNA经Hind Ⅲ酶切后均出现了杀虫晶体蛋白基因片段,没有酶切的A1植株DNA在50kb处具有杂交性,表明杀虫基因均已整合到棉花基因组中.组织化学法检测的结果证明,与aizawai 7-29杀虫基因融合的GUS基因(二者共用1个CaMV 35S启动子和1个终止子.)在棉花(A1,A2)中得到了表达,为杀虫基因在转基因棉花中的表达提供了证据.     

由卫星互补DNA单体构建的抗黄瓜花叶病毒的烟草基因工程植株

本文将合成的卫星RNA-1的全长cDNA单体重组到含CaMV-35S启动子的植物表达载体ROK_2上,并将此重组质粒转入含Ti质粒的根癌杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中,用以感染我国推广烟草品种G-140的叶圆片并再生成植株。经CMV强毒分离物接种后,大部分转化植株有大量卫星RNA表达,并表现出症状的减轻。第二代转基因植物仍保持大量卫星RNA的表达及对CMV的抗性并出现基本符合孟德尔遗传规律的分离。经分离和选育我们可得到纯化的抗病毒品种。     

转基因水稻植株再生及外源人α-干扰素cDNA的表达

本文使用转化脂介导转化法(Lipofectin-mediated transformation)成功地将含有人α-干扰素(Hu-α-IFN)cDNA以及与其连锁的新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)基因的E. coli质粒pIG3031导入到水稻(indica type rice)的原生质体内,并由此获得转化愈伤组织。基于Npt-Ⅱ酶活性的测定结果表明转化频率高达10％。筛选出的转化愈伤组织在分化培养基上再生出了完整的籼稻转基因植株。Southern杂交分析证明,外源Hu-α-IFN cDNA己整合到水稻基因组内;RNA条带杂交结果显示,外源Hu-α-IFN cDNA在T-DNA转录子1启动子(P1′)的控制下,在转化水稻细胞中有效地进行了转录;体外生物活性检测表明,转化植株组织抽提物中含有干扰素特有的抗病毒活性,说明外源Hu-α-IFN cDNA可在水稻细胞内正确表达。     

应用电注射法将外源基因导入水稻种胚及获得转基因水稻植株研究

用我们实验室自制的电容放电式电激仪,成功地把质粒pLGVneo2103上的NPTⅡ基因导入两个水稻品种(籼稻品种三二矮和粳稻品种农虎6号)的种子胚细胞中,在含有100μg/ml Km的MS培养基上选择出抗性愈伤组织,并由此通过体胚发生途径再生出转基因植株,NPTⅡ检测和DNA分子杂交证实外源基因已在上述转化体中得以稳定的整合和表达.     

水稻种子贮存蛋白Prolamin 4a基因的组织特异性表达调控

本文分离了水稻中花8号种子贮存蛋白Prolamin基因的5′端调控区域,对其DNA的全序列结构作了分析,表现启动子DNA的典型序列结构。构建了GUS融合基因,利用农杆菌LBA4404双元载体系统转化烟草,分子杂交获得转基因烟草植株,在转基因烟草开花20天时,对烟草种子作GUS基因表达的组织化学分析。实验结果表明Prolamin基因的启动子在种子的胚乳中激活下游GUS基因的表达,这是水稻Prolamin基因5′端调控序列功能的首次报道。     

用花粉管途径获得小麦转基因植株

本文将带GUS标记基因的质粒pBI121用花粉管途径转化普通小麦(T. aestivum L)品种小山3号的小花。从结实的106粒种子中,经点杂交初步筛选,再经Southern分子杂交鉴定,选出5株转基因小麦,转化率为4.7％。同时用荧光法和X-Gluc染色法测试,检测到这些植株中有GUS基因的表达产物β-葡糖苷酸酶(GUS)存在,证明GUS基因已整合到小麦植株中,并能在植物体中表达。     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

人乙肝病毒表面抗原基因在转基因烟草中的表达

本文报道了将乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原基因导入植物中并得到了表达。将人乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原(HBs Ag)基因插入植物双元载体pRoK Ⅱ的CaMV 35S启动子下游,构建重组质粒pRoK Ⅱ-HBs ag,将此质粒导入农杆菌LBA4404中,利用农杆菌感染叶盘的方法转化烟G-140品种,得到了抗卡那霉素的转化植株,并进一步获得了后代植株。酶联免疫分析表明转化植株及其后代均能产生具免疫活性的HBs Ag;免疫吸附电镜观察表明,转化植株产生的HBS Ag呈典型的直径为22 nm的颗粒。本文显示了用植物廉价生产HBs Ag的可能性。     

人α-干扰素cDNA在转化的烟草植株中表达

本试验成功地将人的α-干扰素cDNA导入烟草细胞中,并得到了产生活性干扰素的转化烟草植株。将人的α-干扰素的cDNA通过平头末端连接的方法插入到植物表达质粒pAP2034中的T-DNA转录子1的启动子及其转录子7的加尾信号间的BamHI位点,构建了重组质粒piG3031,将此重组质粒导入Ti质粒载体pGV3850的T区,利用农杆菌感染叶盘的方法转化普通烟草1551,得到了抗卡那霉素的转化植株。DNA的Southern杂交表明:人的α-干扰素基因随同T-DNA一起整合进了烟草基因组中,新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)的检测表明:转化植株之所以能抗卡那霉素是因为NPTⅡ酶基因表达的缘故。而干扰素的生物活性检测的结果说明转化植株能产生有活性的α-干扰素。     

转基因作物pat蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法研究

将克隆到的pat基因构建原核表达载体pET30(+)-pat并在大肠杆菌中进行表达,分离纯化得到高纯度pat蛋白。用所得到的pat蛋白制备了兔多克隆抗体和鼠单抗2F6。多抗效价>8000,单抗效价为5×104;单抗为IgG1类,轻链为κ型。基于抗pat蛋白单克隆抗体和兔多克隆抗体建立了双抗夹心酶联免疫分析方法(Sandwich ELISA)。检测范围为1.6~100μg/L,线性回归方程y=0.6914x-2.572,决定系数为0.9951。用所建立的方法测定了5个转基因抗虫棉和2个非转基因棉花品种叶片中pat蛋白的含量,其中转基因抗虫棉中的3个品种检测出pat蛋白,其余均未检出pat蛋白。     

双抗转基因烟草纯合系的选育及田间试验

为了将双抗转基因烟草推向实用,进行了双抗转基因烟草纯合系的选育。在试验田中利用人工攻毒进行了T1代植物的抗病毒特性的分离试验;在抗性良好的T1植株的后代T2代植物上进行了田间的病毒接种试验和转基因表达的分析,从中选育出双抗转基因烟草纯合系。又于试验田中,在这些纯合系后代T3代上验证了抗病毒特性的遗传稳定性。在转基因表达分析中,发现CMV外壳蛋白基因的表达在翻译水平上受到抑制。     

由卫星互补DNA单体和双体基因构建的抗黄瓜花叶病毒的转基因番茄

本研究是用卫星cDNA单体和双体基因获得抗黄瓜花叶病毒的转基因番茄。将单体和双体基因组建植物基因载体ROK2,通过三菌结合把基因引入根癌脓杆菌并感染转化番茄获得再生转基因植株。接种攻毒试验表明,卫星cDNA转基因番茄能够干扰病毒的复制,减轻症状程度表现出对CMV的显著抗病性,经过三代检测选育也获得单株纯化的转基因植物株系。初步的田间实验证明,转基因植株在自然条件下,也表现出对CMV的抗病性,表现了良好的生产潜力,为解决我国番茄等作物的病毒病开辟了新的途径。     

人生长激素基因在花叶芋中的整合与表达

本试验将人生长激素(hGH)基因插入质粒载体pLGV1103中,构建了重组质粒pLB-9,将此重组质粒引入携带Ti质粒pGV3850的农杆菌,经同源重组,获得共整合重组体pGL198(hGH)Ti质粒。用叶盘共培养法,使pGL198(hGH)转化单子叶植物花叶芋(Caladium bicolor),获得转基因再生植株。经胭脂碱、新霉素磷酸转移酶、Southern印迹以及Western印迹等分析,表明hGH基因已整合到花叶芋DNA中,并且合成了分子量为22kD的表达产物。     

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的百脉根(Lotus corniculatus L.)的转化

本文报道一个简单有效的豆科植物转化再生实验系统。百脉根(品种:里澳)子叶外植体,被含非致瘤性Ti质粒载体的根癌农杆菌感染。该载体带有一个嵌合的npf-Ⅱ基因和一个胭脂碱合成酶基因。在合卡那霉素的选择培养基上,有40％的外植体在3周内出芽。长大的芽可在生根培养基上生根并移栽成活,开花结实。从一个切块得到了16个抗性再生植株。对再生植株的胭脂碱检测、NPT-Ⅱ活性检测及DNA分子杂交实验及种子后代的胭脂碱检测结果表明,外源基因整合到百脉根基因组上,获得表达并能通过有性生殖过程传递。     

分子生物学手段检测转Bt基因棉花中Cry杀虫蛋白的定性和定量方法

建立了转Bt基因棉花中Cry杀虫蛋白的提取、样品前处理以及酶联免疫(ELISA)定量分析方法,并使用凝胶电泳、普通聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR等分子生物学手段对转基因棉花中的Bt基因进行定性和定量检测.所建立的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白(Cry1Ab蛋白和Cry1Ac蛋白)标准曲线线性关系良好,相关系数r2均大于0.999,相对标准偏差RSD均小于2.0%.方法简单、快速、重现性和精密度好,可为农业食品行业和环境领域科研人员提供一种简便快速地从转基因棉花中检测Bt毒蛋白的分析方法.     

电击法磁性纳米颗粒作为水稻转基因载体的研究

建立了以磁性纳米颗粒为载体,由电击法介导基因导入植物细胞的优化方法。制备了粒径小于10nm的磁性纳米颗粒,与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因融合制备基因载体,同时,制备水稻悬浮细胞,加入电极杯中,调节电击条件为:电压分别是800,1000和1200V,电容25μF,电阻200Ω,直径10mm,电击数次。利用倒置荧光显微镜观察转化后的悬浮细胞,可以明显看到绿色荧光蛋白在水稻细胞内表达。说明纳米颗粒基因载体在电击作用下能有效进入细胞,利用磁性纳米颗粒作为基因载体电击法转化植物细胞初步成功。     

稀土元素在土壤-水稻体系中的迁移与吸收累积特征

通过在天然水稻土中施用不同浓度稀土开展为期两年的水稻盆栽实验,在不同生长期系统观测了水稻植株样品的生物量,同时利用ICP-MS测定了土壤及水稻植株各器官中14种稀土元素的含量,并对植株体内稀土含量分布模式及各器官对土壤中稀土的富集与分异进行了对比研究。结果表明,无论苗期还是成熟期,当外施稀土量超过400 mg.kg-1时,水稻植株生物量即开始呈下降趋势,当外施稀土达500mg.kg-1时,生物量降低10%左右,水稻远低于旱作植物小麦对土壤中外施稀土的耐受能力。对照水稻各器官稀土分布模式与对照土壤相似,均呈轻稀土富集,中、重稀土相对亏损型,Eu轻度负异常;但与土壤不同,水稻根部的Tb及地上部各器官的Eu,Tb均出现正异常。土施大量稀土(400~1200 mg.kg-1)对水稻土及稻根的稀土分布模式有显著影响,对茎、叶略有影响,对籽粒影响不明显。植株各器官对土壤稀土的累积能力依次为根>叶>茎>穗轴、谷壳>籽粒。对照水稻根部对土壤中各稀土元素的吸收积累能力大致相同,仅对Tb有更强的选择性吸收。地上部各器官对中、重稀土的累积能力大于轻稀土,并多数对Eu及Tb有更强的累积。水稻的根部及叶、茎对外施稀土有更强的吸收累积能力,随外施稀土浓度增加,其富集系数随之增高,而穗轴和谷壳、籽粒的富集系数变化不大。植株各器官及籽粒对外施稀土中的Nd都表现出更强的吸收累积作用。     

表达烟草花叶病毒外壳蛋白的转基因烟草及其对TMV的抗性

利用体外重组DNA技术构建携带烟草花叶病毒(TMV,国内流行的普通株)外壳蛋白基因(CP)的中间表达载体,通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒,重组TMV-CP基因被转移至烟草细胞,并获得大量再生的转基因烟草。工程烟草的基因组经Southern印迹法分析证明,CP基因在再生工程株染色体中有1—5个拷贝的插入。分子杂交分析确证TMV-CP基因在转基因株中获得正确表达,其mRNA和蛋白产物的丰度分别达0.005—0.01％及0.05—0.2％。攻毒实验表明90％以上的能表达TMV—CP基因的工程烟草能不同程度地抑制病毒的复制、扩散,并显著延缓,减轻系统病状的发生。有3株工程植株直至花期无病状表现,生长正常。这一抗性作用机制在于转化细胞中的外壳蛋白在病毒侵染早期有效地抑制了入侵病毒颗粒的脱壳,从而阻断病毒的复制。     

水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶的表达、纯化及晶体生长条件初筛

将水稻PHGPx(OsPHGPx)的编码序列克隆到表达载体pGEX-6P-1上, 并转化为大肠杆菌进行表达. 通过GST亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析, 制备了可用于晶体学研究的OsPHGPx, 其纯度超过95%, 具备明显的PHGPx活性. 质谱显示OsPHGPx的精确分子量为19642.5553, 与理论分子量基本一致. OsPHGPx在多个晶体生长条件下出现微晶. 三维结构同源建模显示 OsPHGPx的结构为硫氧还蛋白折叠形式.