重组大鼠溶菌酶N端多肽的原核表达及其对晚期糖基化终产物的结合作用

目的:探讨溶菌酶N端多肽片段基因的重组并在原核中表达,研究该片段与晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)的结合作用。方法:从SD大鼠外周血白细胞中抽提总RNA,经逆转录并扩增大鼠溶菌酶N端基因片段,以质粒pET-30 a( )为载体构建表达质粒pLY77。含pLY77的工程菌Rosetta(DE3)经IPTG诱导,对该重组多肽进行高效表达。表达产物经N i -NTA琼脂糖柱层析纯化后,得到的溶菌酶N端多肽片段LY77经SDS-PAGE和W estern印迹法鉴定,ELISA法分析体外结合活性。结果:LY77在Rosetta(DE3)中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,相对分子质量约为11 000;LY77对体外制备的晚期糖基化蛋白BSA-AGEs具有显著的结合活性。结论:LY77对AGEs具有很高的亲和力,为进一步探讨LY77可能应用于体内促进AGEs的清除和参与免疫调节作用奠定基础。     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法，用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A．从该蛋白编码序列中设计引物，以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段．将所得片段与pMDl8-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，从转化平板上挑出菌落，用碱裂解法提取质粒，通过PCR和酶切分析，筛选到阳性克隆，测序结果与文献报道结果一致．提取质粒，用BamHI和XhoI酶切，回收目的片段，分别克隆到原核表达载体pET28a（4-）和pGEX-6P-1中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）菌中，筛选出阳性克隆，构建了人扭转蛋白A原核表达载体．IPTG诱导该工程菌，培养并离心收集．SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达．     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(I)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法,用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A.从该蛋白编码序列中设计引物,以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段.将所得片段与pMD l8-T载体连接,转化到JM l09大肠杆菌中,从转化平板上挑出菌落,用碱裂解法提取质粒,通过PCR和酶切分析,筛选到阳性克隆,测序结果与文献报道结果一致.提取质粒,用BamHI和XhoI酶切,回收目的片段,分别克隆到原核表达载体pET28a( )和pGEX-6P-1中,转化JM l09受体菌,从JM l09受体菌中提出质粒,再转化到BL21(DE3)菌中,筛选出阳性克隆,构建了人扭转蛋白A原核表达载体.IPTG诱导该工程菌,培养并离心收集.SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达.     

人神经营养素-4基因的原核表达与纯化

以人外周血淋巴细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出神经营养素-4基因(NT-4)成熟蛋白的DNA序列,并将其克隆到表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后高效特异表达了分子量约为35kD的蛋白,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经Ni^2 -NTA树脂亲和层析纯化,得到了纯度达94％的NT-4成熟蛋白的融合蛋白．为进一步研究NT-4的生物学活性及在临床治疗中的作用打下了基础．     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。     

AtGT-3b基因克隆及原核表达与纯化

GT-3b转录因子是一个受NaCl和病原体诱导表达的GT-1-like转录因子,它能与GT-1 cis-element( GAAAAA)相互作用,促进下游基因的表达,在植物耐盐中起着重要的调节作用.通过分离了拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGT-3b基因,克隆到原核表达载体pCold TF中,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行融合表达;通过纯化得到AtGT-3b融合蛋白,以期用于研究其与GT-1顺式作用元件在体外的相互作用.     

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT-PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18-T载体中并测序．将其定向连入原核表达载体pET32a( ),获得了重组表达载体pET32a( )／hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合．然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30％．经Ni^2 -NTA树脂亲和层析柱纯化获得纯度大约90％的重组蛋白．     

人表皮生长因子原核表达及活性鉴定

人表皮生长因子(hEGF)是由53氨基酸组成的小分子多肽,它通过与膜受体的相互作用调节多种类型的细胞增殖。为获得具有生物活性的基因工程产品hEGF,设计在hEGF基因5’-端插入功能序列与基因融合,经合成基因、双酶切连接,构建了重组原核表达载体pBV-F-hEGF,并导入大肠杆菌HB101菌株。工程菌在37℃LB培养基中培养至对数生长期,并在42℃温度条件下诱导表达蛋白F-hEGF。以5 000 r/min离心收集细胞,利用超声波破碎细胞,以10 000 r/min离心20 min收集包涵体沉淀。含有F-hEGF的包涵体溶解后,采用Ni-NTA柱纯化目的蛋白,并用SDS-PAGE鉴定目的蛋白。利用免疫组化反应和MTT方法分析F-hEGF与其膜受体EGFR的特异性结合活性和细胞增殖活性。结果显示,融合蛋白F-hEGF得到高效表达,表达量在35%左右,纯化的蛋白浓度为3.1 mg/mL,F-hEGF与膜受体能发生特异性结合,具有明显的促细胞增殖活性。本研究构建了表达生物活性F-hEGF的工程菌,为hEGF进一步的临床和开发应用提供依据。     

EDSV六邻体蛋白基因克隆与原核表达载体构建

应用降落PCR技术扩增出减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因并将其克隆至pMDT-18载体上,经酶切、PCR鉴定及测序结果表明插入的片段为目的基因,全长2．733kb,共编码910个氨基酸。切下该目的基因定向克隆至pET-28a质粒构建了六邻体蛋白基因原核表达载体pET28a-hexon,经各种酶切、PCR鉴定及进一步测序后证明六邻体蛋白基因片段所插入的位置、大小、核苷酸序列和阅读框架正确无误,从而为下一步的表达及进一步阐明EDSV六邻体蛋白基因结构与功能的关系和减蛋综合征基因工程苗的研究奠定了良好基础。     

人Delta-like4ext-26-217蛋白原核表达载体的构建及表达

构建人Delta-like4ext-26-217原核表达载体并表达。采用PCR方法扩增hDll4ext-26-217多核苷酸序列,克隆入pMD18T载体。测序正确后,将其亚克隆入pET32a( )原核表达载体,获得pET32a( )-hDll4ext-26-217载体。以该载体转化E.coli菌株BL21,IPTG诱导其表达。采用SDS-PAGE、Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达。结果表明,采用SDS-PAGE,Western Blot等方法均可检测到目的蛋白TRX/hDll4ext -26-217,分子量约42.2 KD,主要以包涵体形式大量存在。以上结果为Detla-like4功能的进一步研究奠定了基础。     

翘嘴鳜髓过氧化物酶基因克隆及重链序列的原核表达

利用RT PCR和RACE PCR方法,从翘嘴鳜中克隆出髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）cDNA全长。其开放阅读框有2?292个核苷酸,编码763个氨基酸的蛋白。虽然序列相似性分析发现该蛋白与哺乳动物MPO相似性为64%～65%,但分子质量大小相近。翘嘴鳜含有1个与人MPO相似的血红素基,1个保守的Ca2+结合位点,6个分子内二硫键,以及6个糖基化位点。由此推测翘嘴鳜MPO蛋白的空间结构及催化机制可能与哺乳动物的相似。将翘嘴鳜MPO的部分DNA序列连接到pET 32a c(+)载体上,成功构建了1个重组表达质粒pET MPO,该质粒在大肠杆菌（DE3）中获得了高效表达。另外,利用重组蛋白N末端带有的6×His标签,通过Ni2 NTA柱纯化获得了翘嘴鳜MPO重组蛋白。     

水貂朊蛋白前体基因的原核表达

 构建了水貂朊蛋白前体基因的表达载体,所筛选出的阳性克隆质粒经转化表达菌BL21(DE3)后,收获表达菌,纯化鉴定表明获得了目的产物.     

菠菜43 kD叶绿素a结合蛋白编码基因克隆及原核表达条件优化

将菠菜43 kD叶绿素结合蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-psbC转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导实现了外源基因的可溶性表达.探讨了含组氨酸标签融合蛋白的最佳表达条件(包括表达单克隆、时间、温度对表达的影响).利用Ni2+-Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出His-apo CP43蛋白.体外重组实验证实 His-apo CP43能特异结合叶绿素a,经过温和电泳分离纯化所得体外重组色素蛋白复合物具有与提取自类囊体膜的天然CP43相似(但不完全相同)的荧光特性.     

Cloning, construction of prokaryotic expression vector and expression ofEscherichia coli cytosine deaminase gene

Cytosine deaminase gene ofEscherichia coli strain H-30 was cloned, and its initiation codon of ‘GTG’ was mutated to ‘ATG’ by PCR. Prokaryotic recombinant expression vector pBV220-CD was constructed. Clone with high enzyme activity were selected by detecting their specific activity of cytosine deaminase. 5-FC(5-FC, 5-fluorocytosine) could induce the lethal toxicity to cells containing active CD gene. DNA sequence analysis indicated that there were 16 altered bases and 5 of them resulted in the alteration of amino acids in predicted peptide by comparing DNA sequence of the clone H-30-CD-11 with high enzyme activity with CD gene reported in Gene Bank.