变性剂对重组牛肠激酶活性的影响

肠激酶(EK,EC 3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶.以小分子荧光物质Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-萘胺为底物,采用荧光跟踪法研究了变性剂盐酸胍、硫脲、尿素对重组牛肠激酶(rEK)活力的影响及抑制动力学.结果表明:盐酸胍、硫脲、尿素均对该酶的活性有较强的抑制作用,它们对该酶的半抑制浓度(IC50)分别为0.025,0.080和0.750 mol/L.研究的3种变性剂对该酶的抑制均显示可逆抑制机理;抑制类型也均为竞争性类型,测定它们对酶的抑制常数KI分别为0.015,0.060和0.553 mol/L.     

牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆及融合表达载体的构建

肠激酶(Enterokinase,EK)是目前生物制药领域纯化重组蛋白产品时用于切割融合蛋白的首选工具酶之一．为克隆表达牛肠激酶催化亚基(EKL)编码的基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售肉牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCm-T载体中进行全序列分析．结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致．随后,将目的基因片段插入pET32a融合型表达载体中．经测序证实其重组DNA5’端多克隆位点与重组片段的接口处核苷酸顺序准确无误,所表达重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量为50kD,表达量达38％,为进一步进行Enterokinase催化亚基蛋白表达及活性研究奠定了基础．     

牛肠激酶轻链基因的构建与原核表达

肠激酶作为一种丝氨酸蛋白酶,能够识别顺序-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,水解赖氨酸C端的肽键.根据NCBI中牛肠激酶基因序列(L19663)设计18条引物,通过重叠延伸拼接PCR技术(SOE-PCR)扩增两端带有酶切位点的牛肠激酶轻链基因.构建表达载体pET32a-EK,表达载体转化E.coli BL21 (DE3),利用IPTG诱导表达嵌合蛋白,并用离子交换柱层析纯化肠激酶,获得了高纯度的重组肠激酶轻链蛋白,为大规模生产打下了基础.     

重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化

密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因(sBEKLC),采用pET-39b( )构建了融合表达载体,在大肠杆菌中进行了成功表达.37℃在含30 mg/L卡那霉素的LB培养基中培养,当细胞密度(D600)达到0.5时,降低温度到28℃,加入终浓度为0.1 mM的异丙基硫代-βD-硫代半乳糖苷诱导外源蛋白表达,继续培养6 h后收集菌体,融合蛋白(DsbA-sBEKLC)产量达到151.2mg/L,相当于80.6 mg/L sBEKLC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提取sBEKLC,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8 mg sBEKLC,经检测sBEKLC具有生物活性.     

牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定

用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.     

肠激酶消化融合蛋白Trx-Exendin-4的特性

选用Invitrogen公司开发的重组肠激酶,在不同反应条件下消化融合蛋白Trx-Exendin-4,用16%的Tricine-SDS-PAGE检测目的多肽Exendin-4与其他切割产物的量.结果表明:温度对肠激酶消化融合蛋白Trx-Exendin-4的影响很大,37℃时酶活力高,以非特异性切割为主;16℃时酶活力居中,特异性切割与非特异性切割共存;4℃时酶活力较低,但以特异性切割为主.获得Exendin-4的最佳消化条件是:1 U肠激酶在4℃条件下6 h消化3 mg的Trx-Exendin-4,效率最高,特异性最好.     

木贼活性成分对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用

以木贼为材料,研究木贼的提取物对蘑菇酪氨酸酶的效应.结果表明,木贼的乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶有较强的抑制作用,其IC50值为0.375 mg/mL,抑制机理为可逆混合型.DPPH实验显示木贼的乙醇提取物具有较强的抗氧化作用,说明木贼乙醇提取物通过清除氧自由基来抑致黑色素生长的作用.     

人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

研究目的：克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化．方法：从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表达载体pBV220中,构建成融合型表达载体pBV—EKL,转化大肠杆菌BL21（DE3）,调节温度至42℃诱导重组蛋白表达;通过镍亲和层析纯化得到重组蛋白．结果：所表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析,相对表观分子质量约为31kDa,表达量占菌体总可溶蛋白量的46％;通过镍亲和层析纯化得到的重组蛋白经复性后显示出具有催化切割活性．结论：成功构建了能大量表达重组人肠激酶轻链的菌株,为进一步进行重组人肠激酶活性的研究及其在生产和医学方面的应用研究奠定了基础．     

重组肠激酶催化亚基在毕氏酵母中的高密度发酵、纯化及活性鉴定

应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚基(EKLC)表达并分泌至酵母培养基中.高密度发酵后,经超滤浓缩,采用SP Sepharose F.F一步纯化得到纯度达98%以上的重组目的蛋白,活性达到2.3 U/uL.上述结果表明,本实验成功获得了肠激酶催化亚基,它是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.     

稀土等对霍山石斛组培苗石斛多糖含量的影响

以霍山石斛试管苗为材料,研究硝酸镧稀土(10~40 mg/L)、水杨酸(0.2~5.0 mg/L)和L-赖氨酸(0.5~12.5 mg/L)对石斛多糖含量的影响,并对石斛多糖提取工艺进行探讨。结果表明:稀土镧和L-赖氨酸对石斛多糖含量具有极显著影响,水杨酸有显著影响,在各自浓度范围内提高石斛多糖含量最适浓度分别为20、2.5和0.2 mg/L,与对照相比多糖含量(质量分数)分别增加76.33%、77.11%和23.60%。正交试验表明石斛多糖提取工艺的最佳方案为:100 mL的石油醚 100 mL体积分数为80%的乙醇 40 mL的料液。各因素对霍山石斛多糖提取的影响大小顺序依次为:体积分数为80%乙醇量、石油醚量、料液量。     

不同种公牛精液对牛卵母细胞体外受精效果影响的研究

分别利用不同个体的海伏特、安格斯和荷斯坦种公牛精液进行体外受精，观察了不同品种不同个体种公牛精液的体外受精效果，利用五种海伏特种公牛精液进行体外受精后卵裂率为１７．６％～７４．７％，囊胚发育率为１．０％～３２．６％，不同个体间差异极显（Ｐ〈０．０１）。利用五种安格斯种公牛精液进行体外受精后卵裂率为３４．７％～８５．３％，囊胚发育率为６．２～４０．５％，不同个体间具极显差异（Ｐ〈０．０１）。利用     

The Effects of Different Culture Systems on the Quality of Bovine In Vitro Fertilized Embryos

研究探讨了不同体外培养条件下牛体外受精胚胎的发育速度及囊胚细胞数，从而了解不同体外培养系统对牛体外受精胚胎质量的影响．实验一中将体外受精卵分别在ＳＯＦ＋牛输卵管上皮细胞（ＢＯＥＣ）和ＴＣＭ１９９＋ＢＯＥＣ两种培养系统内培养，在这两种培养条件下囊胚发育率分别为２２．２％和２１．２％，囊胚细胞数分别为１１３．３±５．０和９７．９±８．３，受精后第６～９ｄ的囊胚出现率分别为４０．１％ａ、３７．０％、１９．２％ｂ、２．７％和１３．５％ｃ、３２．７％、３６．５％ｄ、１７．３％（ａ＞ｃ，Ｐ＜０．０１，ｄ＞ｂ，Ｐ＜０．０５），表明牛体外受精卵在ＳＯＦ＋ＢＯＥＣ中的发育速度快于在ＴＣＭ１９９＋ＢＯＥＣ中．实验二中将体外受精卵分别培养于ＳＯＦ＋ＢＯＥＣ、ＳＯＦ＋牛卵丘细胞、ＳＯＦ＋ＢＳＡ三种培养系统中，结果囊胚发育率分别为３５．５％ｅ、２９．４％和２２．４％ｆ（ｅ＞ｆ，Ｐ＜０．０１），囊胚细胞数分别为１１７．３±８．０ｇ、９４．２±９．３和９０．２±９．４ｈ（ｇ＞ｈ，Ｐ＜０．０５）．实验三观察了体外受精胚胎在ＳＯＦ＋ＢＯＥＣ培养条件下发育速度与囊胚细胞数的关系，结果第６～９ｄ的囊胚细胞数分别为１１０．８±１０．２ｉ、１２８．     

几种效应物对黑曲霉果胶酶活力的影响

研究了几种效应物对黑曲霉果胶酶活力的影响。结果表明：变性剂脲与SDS对果胶酶活力的抑制作用呈现出浓度效应，0．5mmol／L SDS能使酶活力下降95．9％，5mol／L的脲能使果胶酶活力下降95．6％；三种伯醇和丙酮对果胶酶活力具有抑制作用，15％的甲醇、乙醇、正丙醇和丙酮可分别使果胶酶活力下降18．8％、25．5％、36．1％和84．4％；而乙二醇和丙三醇对酶活力的影响表现为激活效应，15％的乙二醇和丙三醇可分别使酶活性提高22．9％和6．9％；Cu^2＋和Fe^3＋对果胶酶活力的抑制作用呈浓度梯度效应，EDTA对酶活力没有影响，说明果胶酶为非金属酶类。     

不同体外培养系统对牛体外受精胚胎冷冻解冻后孵化能力的影响

采用ＳＯＦ和ＴＣＭ１９９与输卵管上皮细胞共同培养系统对牛体外受精卵进行培养,观察了在这两种培养条件下得到的囊胚经冷冻—解冻后的孵化能力．在ＳＯＦ＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２１．３％,囊胚经冷冻—解冻后的孵化率为３７．５％;在ＴＣＭ１９９＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２６．０％,囊胚经冷冻—解冻后的孵化率为４７．７％．研究结果表明这两种体外培养系统的培养效果无显著差异（Ｐ＞０．０５）．