小麦AGPase胞质型小亚基SSUⅠ的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基（AGPase plastic small subunit,SSU Ⅰ）的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSUI的cDNA全长为1465 bp（GenBank No.EF405961）,编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1 423 bp.同源性比较结果表明：与GenBank上已报道的SSU I基因（X66080,AF244 997,Z48562）同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的SSU I基因的过表达载体pWM101SSU Ⅰ S;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU Ⅰ的反义表达载体pBI121SSU Ⅰ A.同时还克隆出SSU Ⅰ基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU Ⅰ.     

水稻OsWHY1基因克隆及过表达与RNAi载体构建

Whirly蛋白是一种单链DNA结合蛋白,是植物特有的存在于细胞核与叶绿体中的双定位蛋白.本研究以水稻品系金23B为材料,从cDNA中克隆得到水稻whirly蛋白基因(OsWHY1).该基因的c DNA全长为1 250 bp,开放阅读框大小为825 bp,编码274个氨基酸.结构域分析结果表明OsWHY1蛋白序列具有whirly蛋白家族共有的whirly结构域.蛋白质序列比对分析表明,OsWHY1蛋白序列与玉米(Zea mays),小米(Setaria italica),黍(Panicum miliaceum),高粱(Sorghum bicolor),大麦(Hordeum vulgare)的蛋白序列相似性分别为79. 8%、83. 1%、82. 7%、78. 7%和75. 3%.此外,本研究通过酶切酶连的方法成功构建了pU1300-OsWHY1过表达载体和PTCK303-OsWHY1 RNA干扰载体,为进一步研究OsWHY1基因在水稻持绿性中的功能打下基础.     

小麦atpC基因植物超量表达载体的构建

线粒体ATP合成酶是氧化磷酸化过程中ATP合成起关键作用的多亚基复合体,但近来发现它们在植物应对非生物胁迫反应中起着十分重要的作用。因此,对ATP合成酶的各亚基基因功能的研究有助于阐释其在植物逆境条件下的调节机制,并为研究植物抗逆和防卫反应提供新的途径。线粒体ATP合成酶是能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化反应。atpC基因所编码的线粒体ATP合成酶γ亚基是线粒体ATP合成酶的功能亚基。为了进一步研究它在胁迫反应中的功能,以小麦cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出atpC基因。将该基因的cDNA编码序列连接到pCAMBIA1301中,成功构建了小麦pCAMBIA-atpC植物超量表达载体,为后续的转基因研究奠定了基础。     

Mi基因过表达载体和16D10基因RNAi载体的构建及转化

文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘（Citus reticulate）的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR. 通过根瘤农杆菌介导的遗传转化,获得了经PCR检测为阳性的沙田柚转基因植株. 这一结果将为研究Mi基因过表达和16D10基因的RNA干扰对柑橘根结线虫病的抗性影响提供试材和技术支持.     

小麦AL型胞质不育系育性恢复基因的遗传分析

采用AL型细胞质雄性不育系AL18A及保持系18B和恢复系99AR144-1配置杂交组合,利用得到的F1、F2世代以及测交群体aBC1、bBC1和cBC1,对小麦AL型胞质不育系育性恢复基因的遗传行为进行了分析.结果表明,99AR144-1对AL18A的育性由2对主效核基因控制,F2代育性分离表现为15∶1,2对基因具重叠累加遗传效应;bBC1群体分离偏离3∶1.由此初步认为,AL型细胞质背景可能影响恢复基因通过雌配子正常传递.     

水稻精细胞基因RSSG58启动子的克隆分析及表达载体构建

根据分布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基因cDNA序列，以水稻品种“桂朝2号”黄化苗组DNA为模板，用PCR方法克隆出RSSG58在起始密码子以前的上游调控序列Pr58，经过Pr58启动子进行的鉴定和分析表明，具备大多数高等植物启动子的保守元件，预计它的RSSG58基因在特异表达方面具有一定的作用。为了鉴定RSSG58基因的基本启动子元件，将RSSG58基因5′侧翼序列做缺失片段分析，由PCR从Pr58中得以3个不同大小两端带有HindⅢ，BamHⅠ酶切位点的片段Pr58Ⅰ，Pr58Ⅱ和Pr58Ⅲ，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP）中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报造基因GFP的植物表达载体pRGFPⅠ，pRGFPⅡ和pRGFPⅢ，用于农杆菌介导法水稻遗传转化。其目的是为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定基础。     

脉胞菌hH3v基因的初步研究及原核表达载体构建

根据植物表达载体pET52（b）多克隆位点和脉胞菌着丝粒结构相关蛋白CenH3的编码基因hH3v序列，设计引物，通过PCR扩增将基因两端加上KpnⅠ和SacⅠ酶切位点，经双酶切后将hH3v插入表达载体pET52（b）中，利用热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在选择培养基上挑取单菌落培养，经PCR检测，表明目的基N原核表达载体构建成功，为着丝粒结构进一步的研究提供了基础．     

IFI16基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

为了构建可在人喉癌细胞中稳定表达 IFI16基因短发夹RNA（shRNA）的表达载体,设计合成的IFI16基因shRNA片段,连接到经BamH I和 EcoR I双酶切的pGreenPuroTM shRNA表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取几个抗性菌落,用PCR技术初步进行鉴定,经PCR初步鉴定为重组质粒的一个重组子DNA用测序进一步鉴定,测序结果显示成功构建了 IFI16基因shRNA的表达载体pGreenPuro-IFI16 shRNA 。     

重组人截短型IL—6表达载体的构建及表达

旨在建立人截短型IL-6原核高效表达系统。用PCR方法获得截短的人IL-6基因（rhIL-6cDNA）,将其插入克隆载体pUC18中,经证实后再克隆入表达载体pBV220中,鉴定阳性表达载体。结果建立了截短型IL-6基因的克隆载体,经测序证实完全正确;构建了截短型IL-6的原核表达质粒pBV220/rhIL-6并获得高效表达;初步纯化的表达蛋白的比活性为5×10     

OsICK1 基因植物反义表达载体的构建及遗传转化

OsICK1是水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因.我们构建了水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因(OsICK1)的植物反义表达载体,在农杆菌的介导下尝试使antisense OsICK1 整合到水稻基因组中并初步得到验证.为进一步研究OsICK1 对水稻细胞周期调控的作用奠定了基础.     

Molecular cloning and expression of Pfu DNA polymerase gene and its application in long-distance PCR

A 2.3 kb DNA fragment containing Pfu DNA polA gene was amplified by PCR from total DNA of Pyrococcus furiosus and cloned into a pGEM-T vector. The recombinant clone pT-pfu was digested with Nco I and Xho I and the fragment was inserted into an expression vector pET3d-X. The Pfu polA gene was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The gene product (Pfu) was purified with heat denaturation, polyethylenemine (PEI) precipitation and Bio-rex 70 ion-exchange chromatography. The recombinant Pfu was verified by protein N-terminal sequencing. With the recombinant Pfu, large λ DNA fragments were successfully amplified in long-distance PCR.     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.     

草鱼原肌球蛋白基因的克隆及其组织表达

为揭示原肌球蛋白基因在草鱼肌肉中的作用,利用RT-PCR和RACE技术克隆获得了草鱼原肌球蛋白基因c DNA,并对该基因在普通草鱼和脆肉鲩不同组织中的表达情况进行研究分析。结果表明原肌球蛋白基因c DNA全长序列为1 705 bp,包含387 bp的5′UTR序列,1 307 bp的3′UTR序列和855 bp开放阅读框(ORF)。其ORF编码284个氨基酸。系统进化分析表明普通草鱼与斑马鱼、墨西哥脂鲤的原肌球蛋白基因核苷酸同源性分别是93%和87%,氨基酸同源性分别是96%和93%。在聚类上普通草鱼原肌球蛋白基因与其他鲤科鱼类同源性较高,表明亲缘关系最近,与传统分类相一致。Real time-PCR结果表明原肌球蛋白基因在所检测的普通草鱼和脆肉鲩7个组织中均有表达,原肌球蛋白基因在普通草鱼腹肌中表达最高,其次为前肠。原肌球蛋白基因在脆肉鲩腹肌中的表达低于普通草鱼,而脆肉鲩中肌肉、肝脏、肾脏、前肠、后肠中原肌球蛋白基因表达量大于普通草鱼相对应组织,但差异不显著。     

小鼠ZP2肽的基因克隆和原核表达载体的构建

目的:克隆小鼠卵透明带2(mZP2)肽的基因并构建原核表达载体.方法:从小鼠卵巢组织中分离出mRNA,并以此作为模板,通过RT-PCR扩增出小鼠ZP2肽的cDNA片段,将其克隆到pET原核表达载体.将该重组mZP2基因转化Rosetta-gami(DE3)pLysS菌,通过SDS-PAGE和Western blotti...     

麻疯树P5CS基因的克隆及原核表达

使用RACE技术,从麻疯树叶片中克隆了Δ1吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因,命名为JcP5CS. JcP5CS的cDNA全长2675 bp,包含一个2148 bp的开放阅读框,一个117 bp的5’-非翻译区以及一个410 bp的3’-非翻译区.开放阅读框编码716个氨基酸多肽链,分子量为77.54 kD,预测等电点为6.11.通过与其它物种的P5CS氨基酸序列比对,结果显示,与其他高等植物的P5CS氨基酸序列有很高的同源性.包含谷氨酸激酶和谷氨酸-γ-半醛脱氢酶两个结构域以及ATP及NAD (P     

Molecular cloning and expression of the gene for a human D1 dopamine receptor

The diverse physiological actions of dopamine are mediated by its interaction with two basic types of G protein-coupled receptor, D1 and D2, which stimulate and inhibit, respectively, the enzyme adenylyl cyclase. Alterations in the number or activity of these receptors may be a contributory factor in diseases such as Parkinson's disease and schizophrenia. Here we describe the isolation and characterization of the gene encoding a human D1 dopamine receptor. The coding region of this gene is intronless, unlike the gene encoding the D2 dopamine receptor. The D1 receptor gene encodes a protein of 446 amino acids having a predicted relative molecular mass of 49,300 and a transmembrane topology similar to that of other G protein-coupled receptors. Transient or stable expression of the cloned gene in host cells established specific ligand binding and functional activity characteristic of a D1 dopamine receptor coupled to stimulation of adenylyl cyclase. Northern blot analysis and in situ hybridization revealed that the messenger RNA for this receptor is most abundant in caudate, nucleus accumbens and olfactory tubercle, with little or no mRNA detectable in substantia nigra, liver, kidney, or heart. Several observations from this work in conjunction with results from other studies are consistent with the idea that other D1 dopamine receptor subtypes may exist.     

中性蛋白酶基因的克隆与表达载体的构建

中性蛋白酶是指其最适作用pH为6－7．5的一类蛋白酶，其主要作用为皮革脱毛、毛皮软化、制蛋白胨、 酵母膏、肝宁及用于食品工业等。我们从枯草杆菌中克隆出中性蛋白酶基因，并成功构建了中性蛋白酶基因表达载体，为下一步实现蛋白酶的高效表达奠定了基础。     

鳜鱼肥胖基因的克隆与组织表达

为了研究脊椎动物肥胖基因(obese gene, ob)结构与功能关系,利用PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肥胖基因全长序列:鳜鱼ob基因全长1 398 bp, 由2个外显子和1个内含子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸. 应用Genome Walker方法克隆得到一段长为357 bp的鳜鱼ob基因5′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件. 我们将克隆得到的鳜鱼ob基因编码氨基酸序列leptin与其他物种leptin序列分别进行同源性比较,并构建系统进化树,发现虽然不同物种间leptin序列差异非常大,但进化树分析显示所有的leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,各自聚集成簇. 最后通过荧光实时定量PCR方法研究鳜鱼不同组织ob基因的表达水平,与哺乳动物ob基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼ob基因在所有被检测组织中均有表达,在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达,说明鱼类ob基因的表达分布及其调控机制可能与哺乳动物存在差别.     

Molecular cloning, expression and regional distribution of rat ciliary neurotrophic factor

Ciliary neurotrophic factor (CNTF) was originally characterized as a survival factor for chick ciliary neurons in vitro. More recently, it was shown to promote the survival of a variety of other neuronal cell types and to affect the differentiation of E7 chick sympathetic neurons by inhibiting their proliferation and by inducing the expression of vasoactive intestinal peptide immunoreactivity (VIP-IR). In cultures of dissociated sympathetic neurons from newborn rats, CNTF induces cholinergic differentiation as shown by increased levels of choline acetyltransferase (ChAT). This increase is paralleled by a reduction of tyrosine hydroxylase (TH) activity. Moreover, CNTF promotes the differentiation of bipotential 02A progenitor cells to type-2-astrocytes in vitro. To help establish which, if any, of these functions CNTF exerts in vivo, it is necessary to determine its primary structure, cellular expression, developmental regulation and localization. The complementary DNA-deduced amino-acid sequence and subsequent expression of cDNA clones covering the entire coding region in HeLa-cells indicate that CNTF is a cytosolic protein. This, together with its regional distribution and its developmental expression, show that CNTF is not a target-derived neurotrophic factor. CNTF thus seems to exhibit neurotrophic and differentiation properties only after becoming available either by cellular lesion or by an unknown release mechanism.