蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达

作为一种天然的抑菌物质,溶菌酶对抗生素耐药菌有较强的杀伤作用,具有无耐药性、无残留等特点,被认为在诸如动物饲料、药品等领域可有效代替抗生素,改善滥用抗生素所引起的一系列问题,市场前景巨大。通过微生物发酵大规模生产重组溶菌酶符合市场发展趋势,由于目前生产的菌株表达量偏低,限制了溶菌酶的应用和产业化发展。为提高蛋清溶菌酶的发酵表达量,根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对其编码基因进行密码子优化,并构建了真核分泌表达载体pPIC9K-coEWL,经遗传霉素G418抗性筛选后,获得了一株酵母转化子(G-p-coEWL),其对G418的抗性浓度高达15 mg·mL^-1。在28℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1和甲醇浓度1%的诱导条件下,酵母重组子G-p-coEWL经摇瓶培养72 h,实现了蛋清溶菌酶的分泌表达。在发酵上清液中,总蛋白浓度为 607 mg·L^-1,酶活达到677 U·mL^-1。此外,本实验还比较了葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50和强酸性阳离子交换柱SP-Sepharose FF两种方法对目的蛋白的分离效果,得到 Sephadex G-50的分离效果更好,并在14.4 kDa处得到单一的溶菌酶条带。     

密码子优化的人溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗菌活性分析

人溶菌酶（human lysozyme,hLYZ）是一种天然活性蛋白质,具有抗菌性,目前主要应用于食品添加剂、动物饲料、药物治疗领域。根据毕赤酵母表达偏爱密码子特点,通过优化hlyz基因密码子,人工合成目的基因,构建了分泌表达载体pPIC9K-hlyz。通过电击转化法将pPIC9K-hly质粒重组至毕赤酵母GS115染色体中,经筛选得到重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-hlyz。在28 ℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1、1%甲醇诱导下表达120 h,发酵液上清酶活达到最高,为（2 414.9±108.1）U·mL^-1,蛋白浓度为166.7 μg·mL^-1。发酵液上清经过Sephadex G50纯化,获得较纯的hLYZ,经SDS-PAGE分析,在近14.7 kDa处显示单一条带。抗菌实验结果表明,重组hLYZ对革兰氏阳性菌的抗菌效果大于革兰氏阴性菌;重组hLYZ的抗菌效果是hLYZ标准品的10~20倍。     

2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶在毕赤酵母中的分泌表达

为实现2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶基因(DERA)在毕赤酵母中分泌表达。通过PCR从E.coli BL21基因组中扩增获得DERA序列,并且与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建得到重组质粒pPIC9K-DERA。重组载体经salⅠ单酶切线性化后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞,用MD/MM平板筛选阳性株并在含G418的YDP培养基中筛选多拷贝插入菌株。经PCR鉴定获得一株插入pPIC9K-DERA的多拷贝嗜甲醇重组毕赤酵母菌株。用甲醇诱导该重组菌株,分泌得到具有活性的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶,且72 h时酶活为2.4 U·mg-1。结果表明,2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶可实现在毕赤酵母中分泌表达。     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

草原兔尾鼠ZP3基因密码子优化及其在酵母中的表达

目的:提高草原兔尾鼠(L agurus lagurus)卵透明带3(LZP 3)基因在酵母细胞中表达的水平.方法:利用重叠PCR技术,定点突变LZP 3基因上6个稀有的密码子簇,将LZP 3基因中11个稀有的密码子更换成毕赤酵母(P ich ia Pastoris)最常用的相应密码子.将获得的LZP 3突变基因(LZP 3m)插入pGAPZαA中,构建穿梭表达载体.以重组体转化P ich ia Pastoris SM D 1168菌株进行表达.结果:LZP 3m基因的表达量比野生型LZP 3基因明显提高.结论:通过密码子优化,能显著提高LZP 3基因在酵母细胞中的表达水平.     

毕赤酵母对不同细菌抗原的差异性表达

利用毕赤酵母研究真核细胞对不同的原核细菌可溶性蛋白抗原的差异性表达。用PCR技术扩增3种不同的结核杆菌抗原基因Ag85a、ESAT6、以及rdESAT6和1种肺炎链球菌抗原基因PsaA。将它们分别连接到pPic9k载体中,在毕赤酵母中进行表达。然后采用离子交换柱或镍柱(Ni-NTA)分别纯化这4     

人白细胞介素10(hIL10)在毕赤酵母中的表达

利用PCR技术从质粒pcDNA3．1／GS扩增得到hIL10基因．将其插入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K／IL10，转化毕赤酵母GS115，筛选出整合了多拷贝白细胞介素10基因的菌株，经摇瓶培养，0．5％甲醇诱导表达、SDS-PAGE分析显示，表达产物以可溶性分子形式存在于上清中，诱导4d的表达量达到高峰．Western印迹表明．表达产物具有良好的抗原性和特异性．     

猪胃蛋白酶原A基因cDNA的克隆及其表达

根据GenBank中发表的猪胃蛋白酶原A（pepsinogen）基因序列设计引物，采用RTPCR技术，成功获得了猪胃蛋白酶原A基因，该基因全长1240bp，将该基因克隆到表达载体pPIC3．5K的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点构建重组表达质粒，通过电转化方法将重组质粒转化毕赤酵母GS115，检测结果表明猪胃蛋白酶原A基因在毕赤酵母中得到了表达．     

人乙醇脱氢酶ADH1B2在毕赤酵母中的表达及活性分析

根据GeneBank中人乙醇脱氢酶ADH1B2基因序列设计引物,以人肝脏总RNA为模板,反转录获得人乙醇脱氢酶基因.将克隆基因与表达载体pPICZB连接,测序正确的pPICZB-ADH1B2电转化毕赤酵母GS115;重组毕赤酵母工程菌经0.5%（v/v）甲醇诱导72 h后目的蛋白以可溶形式表达,经DEAE-Sepharose FF纯化后蛋白酶活性可达8 000 U·mg^-1.同时构建重组质粒pCDNA3.1-ADH1B2转染HepG2人肝癌细胞,发现细胞内ROS/GSH水平降低,Akt磷酸化水平降低,细胞活性下降.为临床酒精中毒预防和治疗药物的研发以及ADH在肝脏肿瘤方面的研究提供了理论基础.     

蝎神经毒素AaIT的表达及功能分析

在不改变氨基酸编码序列的情况下，根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计并人工合成了适合于大肠杆菌表达的蝎神经毒素AaIT基因．将该基因插入到大肠杆菌表达载体PET32a＋中，得到重组质粒PET32a-AaIT，将该质粒转入带有trxB／gor双突变的大肠杆菌Origami（DE3），重组菌株经IPTG诱导后，获得町溶性表达产物，但该表达产物没有生物学活性．把此基因插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC6αA构建重组质粒pPIC6αA-AalT，转化毕赤酵母（X-33），经甲醇诱导后，获得高水平的分泌表达（20mg／L）．表达产物喂食银纹夜蛾及甜菜夜蛾没有表现出生物活性，经注射有活性．