人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）在大肠杆菌中的表达,…

人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ重组在表达质粒ｐＤＲ７２０中。在Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００中获得了表达，表达水平为２％。以醋酸锌显色ＰＡＧＥ凝胶回收ｔ－ＰＡ表达条带，进行复性处理。复性产物经Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，Ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，纯化得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染一条带纯度，比活为４，０００ｍｏｌ／ｓ·ｇ的人ｔ－ＰＡ。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究

将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20％,表达产物经体外变复性、TI—Sepharose亲和层析、SP-Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95％以上,比活大于500000IU／mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准．其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符．同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究．     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT-PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2．1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a／K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌．经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％．该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性．     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的药效学研究

犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%、42.5%;心肌梗死范围明显缩小.血纤维蛋白原明显降解,凝血酶原时间、凝血酶时间及陶土激活部分凝血酶时间明显延长,但抗凝血酶活性无显著改变.伤口出血量增加,出血时间延长.以上指标与等剂量(5×105IU/kg)的德国BoehringerMannheimGmbH产品Retavase作用相似.离体家兔血小板凝集实验结果表明:重组人K2tPA对家兔血小板聚集功能具有明显的抑制作用.     

重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a( )中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础     

组织型纤溶酶原激活剂突变体基因转染细胞株的建立

以脂质体介导法将含有t-PA突变基因的真核表达载体pCSRA及pCSRK分别转染CHO-dhfr^-,经G418及DMEM双重选择,获得两者的稳定表达细胞株。结果表明,表达产物具有良好溶纤活性;Western印迹实验证明,产物具有特异抗原性;经多次传代,细胞株具有良好的稳定性。比较了无血清培养基CHO-S-SFMⅡ与常规培养基DMEM培养条件下pCSRK细胞株产物的表达量,前者约为后者的2倍,表明无血清培养基SFM有可能用于药用性蛋白的生产。实验为t-PA新型突变体的临床应用打下一定基础。     

碳源及氮源Trichoderma reesei306对组织型纤溶酶原激活剂生物合成的影响

本文对不同种类的碳．氮源对Trichoderma reesei306组组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)生物合成的影响进行了研究。结果表明：在所试的各种碳氮源中，碳源以玉米粉和纤维素，氮源以尿素和胰蛋白胨效果最好，通过正交试验确定了液体发酵培养基中碳氮源的最佳组成为：玉米粉20g／l、纤维素30g／l、尿素10g／l、胰蛋白胨2g／l，优化碳氮源后t—PA酶活提高了26％。     

尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)系统在子宫内膜癌中的研究进展

尿激酶型纤溶酶原激活系统是纤溶系统的重要组成部分，它通过水解细胞外间质，参与组织改造和细胞迁移，在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥作用；讨论了uPA系统的结构、作用机理及与子宫内膜癌的关系，旨在为子宫内膜癌的诊断和治疗提供新方法。     

用静息细胞培养法研究影响组织型纤溶酶原激活剂生物合成的因素

建立了基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306生物合成组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)的静息细胞培养系统。确定静息细胞培养基的成分为：葡萄糖1．0g／L，尿素1．0g／L，K2HPO41．0g／L；静息细胞培养的条件为：选择发酵30h的菌体，10％的接种量，pH5．4，150r／min，28℃静息培养12h。并在该静息细胞培养系统中，研究了糖类、有机酸、氨基酸和金属离子等因素对里氏木霉306生物合成组织型纤溶酶原激活剂的影响。     

尿激酶型纤溶酶原激活剂在小鼠皮肤创伤修复中的作用

观察uPA在小鼠皮肤创伤修复中的作用,以及外源性应用uPA对损伤表皮创伤修复的超微结构变化。在创伤部位外源性应用uPA后,利用光镜及扫描电镜等方法,比较观察了不同时间及浓度的uPA对损伤表皮组织修复,尤其是基底细胞迁移的影响,结果发现uPA浓度为100μg/mL及200μg/mL时,与对照组比较,基底细胞提前发生迁移,较对照组早1h。创伤部位外源性应用uPA,有利于表皮基底细胞的迁移,这种促进细胞迁移作用可能对于治疗皮肤创伤早期愈合有重要影响。     

利用氨基苄脒为配基的亲和层析法纯化t—PA

利用氨基苄脒修饰的硅胶为亲和吸附剂纯化组织纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ），讨论了亲和柱体积对纯化效率的影响。由于氨基苄脒对ｔ－ＰＡ的高度特异性，根据ｔ－ＰＡ的上柱量适当调整柱体积，可使纯化倍数达到１４０以上，远高于利用其它亲和吸附剂的结果。     

鼠肾纤维蛋白溶酶原激活酶的纯化和部分鉴定

采用肝素—Sepharose亲和层析和凝胶过滤自鼠肾提取纤维蛋白溶酶原激活酶,产率5.1×10~(-5)％。在还原和非还原状态下SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳及电泳酶谱分析均呈单一区带,证实产物仍保持单链状态。测得其分子量为70000。纤维平板试验和无纤维蛋白溶酶原纤维平板试验证实其活性依赖于纤维蛋白溶酶原。     

人纤溶酶原Kringle 1 结构域在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化

Ｐｌａｓｍｉｎ(ｏｇｅｎ)ｗａｓｋｎｏｗｎｆｏｒｉｔｓｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｓｗｅｌｌａｓｉｔｓω ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ.Ｏｎｅｈｉｇｈａｎｄ 4ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎ .Ｃｏｎｃｕｒ ｒｅｎｔｌｙ 5ｈｉｇｈｌｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｔｒｉｐｌｅｌｏｏｐｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｎａｍｅｄａｓｋｒｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｆｏｒｍｉｎｇ…     

dna Y基因产物提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的表达

对提高人水激酶原ｃＤＮＡ在大肠杆菌中的表达水平进行了研究。通过ＰＣＲ方法在其结构基因５‘端添加起密码子ＡＴＧ，用人工合成的不依赖于ρ因子的终止序列替换 ３’端非翻译区，得到完整的人尿激酶原结构基因。将其克隆在表达质粒ｐＫＫ２３３－２中，转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＡ２２１，人尿激酶原得到初步表达，但表达水平很低，原因可能是人尿激酶原ｃＤＮＡ富含真核细胞偏爱的密码子，而大肠杆菌中识别这些密码子的ｔＲＮ     

牛泡沫病毒BFV3026 gag基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从牛泡沫病毒BFV3026感染的胎牛肺细胞中提取Hirt DNA,PCR扩增BFV3026　gag基因。序列分析确证后，将其克隆于原核表达载体pET32A，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，使Gag蛋白得以高效表达。SDS－PAGE及Western blot证实：表达蛋白占菌体总蛋白的40%，本工作的完成为Gag蛋白功能的研究奠定基础。     

rhBMP-6的表达和纯化

骨形态发生蛋白(bone　morphogenetic protein，BMP)—6属于转化生长因子(transforming growth fac-tor)—β超基因家族，在骨的形成中具有重要作用，并受雌激素选择性上调．本研究利用RT—PCR从人胎盘组织中扩增BMP—6成熟肽的DNA片段，克隆到pGEx—5x—1中，构建GST—BMP6融合蛋白表达载体pGEx—BMP—6，转化E.coli DH5a．克隆质粒转化的工程菌，经IPTG诱导4h后，高效表达GST—BMP6融合蛋白，在SDS—PAGE上出现一新蛋白带，分子量约为42kD，约占总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在．菌体超声破碎，经0．3％N—十二烷基肌氨酸钠(SKL)溶解包涵体，离心后的上清液加入0．6％　Triton　x—100整合SKL，然后利用谷胱甘肽Sepharose—4B亲和层析纯化．结合GST—BMP6的介质经洗涤、xa因子酶切得到纯度达95％的rhBMP—6蛋白。     

大肠杆菌分子效伴侣GroEL和GroES蛋白的高效表达、纯化与鉴定

研究分子伴侣对解决蛋白质折叠的理论问题及基因工程包涵体的实际问题是很有用的。本文讨论的是Ｅ．ｃｏｌｉ的分子伴侣－属于ｈｓｐ６０家族的ＧｒｏＥＬ蛋白及其辅助蛋白ＧｒｏＥＳ。重组质粒ｐＧｒｏＥＳＬ含有大肠杆菌的ｇｒｏＥＬ和ｇｒｏＥＳ基因。利用这个表达载体，经摇瓶发酵，ＩＰＴＧ诱导表达大量的ＧｒｏＥＬ和ＧｒｏＥＳ蛋白。破菌后，上清经ＤＥ５２—ｃｅｌｕｌｏｓｅ柱层析，硫酸铵分级沉淀，ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析，得到纯度分别为８５％和８０％的ＧｒｏＥＬ和ＧｒｏＥＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示ＧｒｏＥＬ和ＧＳ蛋白亚基的分子量与理论值相符，同时还定到了ＧｒｏＥＬ蛋白的ＡＴＰ水解酶活力。这种纯化方法操作简单，重复性好，并且可同时得到ＧｒｏＥＬ和ＧｒｏＥＳ蛋白。这两种蛋白可进一步用于体外变性蛋白重折叠的研究     

MTERF1基因真核表达载体的构建及其在C-33A细胞中的表达研究

采用PCR技术从pGEM-MTERF1重组克隆载体中扩增出人MTERF1基因cDNA的开放阅读框序列,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后,以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1;通过PCR、双酶切和DNA测序方法对重组子进行鉴定;将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1转染C-33A细胞,利用免疫印迹法检测MTERF1蛋白的表达。结果显示,重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1经双酶切鉴定和菌落PCR鉴定均获得大小为1 200 bp的目的条带,DNA测序结果表明该序列与GenBank中人MTERF1基因序列完全相同,插入基因的大小和方向正确;免疫印迹结果表明,MTERF1蛋白的表达水平在转染pcDNA3.1(+)-MTERF1的C-33A细胞中表达高于转染pcDNA3.1(+)的C-33A细胞。通过对人MTERF1基因的真核表达载体的构建,为进一步研究人MTERF1基因的功能奠定了基础。     

血小板衍化生长因子及其受体在人胰腺癌局部浸润转移中作用的实验研究

观察胰腺组织及其癌变标本中血小板衍化生长因子（ＰＤＧＦ）及其受体（ＰＤＧＦＲ）基因表达的变化关系,以探讨它们在人胰腺癌局部侵袭和转移过程中的作用。用诺真法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ）和原位杂交（ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ,ＩＳＨ）方法,采用ｃＤＮＡ探针（ＰＤＧＦＡ、Ｂ,ＰＤＧＦＲα、β）对两株胰腺癌细胞（Ｐａｔｕ８９８８、Ｐａｔｕ８９０２）、１５例胰腺癌手术切除标本和８例正常胰腺组织标本进行杂交检测。胰腺癌组织中,ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ在ＲＮＡ水平的表达与正常胰腺组织相近;而ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ尤其是ＰＤＧＦＲα在ＲＮＡ水平的表达,较正常胰腺组织相对提高。ＰａＴｕ细胞株中,有ＰＤＧＦＡ及其ＰＤＧＦＲβ的表达。ＩＳＨ结果显示：ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ阳性反应深浅不一,胰腺癌与正常胰腺组织无明显差异。胰腺癌细胞中ＰＤＧＦ和ＰＤＧＦＲ均有表达,而ＰＤＧＦＲβ则比较多地定位于结缔组织中的纤维细胞和内皮细胞。ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ可能通过对胰腺癌细胞外基质蛋白降解代谢的调控,共同影响着肿瘤的侵袭和转移过程