实时荧光等位基因特异性扩增法快速检测K-ras癌基因点突变

将荧光定量PCR技术与等位基因特异性扩增(Allele specific amplification, ASA)方法相结合, 发展了一种可以快速检测基因点突变的实时荧光等位基因特异性扩增(Real-time ASA)方法. 将该法用于检测K-ras癌基因第12位密码子发生的点突变, 分别采用针对其不同点突变方式(GAT, GTT, CGT)设计的突变型引物对待测样品进行ASA, 只有突变型样品能被顺利扩增出双链DNA产物, 该产物才能与双链DNA染料SYBR Green Ⅰ结合, 发出荧光信号从而被检测到. 用该法检测31例结肠癌组织中的K-ras癌基因点突变, 其中有15例样品检出为突变型. Real-time ASA法可检测到样品中含量为1/1000的突变型基因, 具有灵敏、快速、简便、安全、高通量和低成本等优点, 可望用于大量临床样本的点突变筛查.     

高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中35种兽药残留量

提出了高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中35种兽药残留量的方法。样品经含1%(体积分数)乙酸的乙腈提取,QuEChERS方法净化,所得净化液以Zobax Eclipse Plus C18色谱柱为分离柱,以不同体积比的0.1%甲酸(体积分数)溶液和乙腈混合液为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾正离子源和多反应监测模式检测。35种化合物的质量分数均在1~50μg·kg-1范围内与其峰面积呈线性关系,方法的检出限(3S/N)在0.02~1.07μg·kg-1之间,测定下限(10S/N)在0.08~3.58μg·kg-1之间。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率在45.6%~121%之间,相对标准偏差(n=6)在2.4%~24%之间。     

激光剥蚀-大气压辉光放电原子发射光谱法中土壤样品分析基质效应研究

采用激光剥蚀-大气压辉光放电原子发射光谱法(LA-APGD-AES)研究了土壤样品中基质效应对于Cd和Pb元素检测结果的影响。选取来自不同地区、主成分含量相差较大的实际土壤样品进行研究。在激光能量60 mJ、激光脉冲数20的条件下,对APGD-AES的参数条件进行优化。放电间距为14 mm、气体流速为130 mL/min、放电电流为27 mA时,信号强度及稳定性最佳。在最佳条件下,采用本方法结合单变量校准模型分别对4种复杂基质土壤中的Cd和Pb进行定量检测,并将检测结果拟合在同一校准曲线中进行分析。对4种不同基质土壤检测所得的Cd和Pb的线性相关系数分别为R²≥0.99和R²>0.97,两种元素LA-APGD-AES测量值与电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测量值的相对误差均在0.4%～11.8%之间;拟合在同一校准曲线中分析所得的Cd和Pb元素的R²变化不明显,两种元素测量相对误差均在3.0%～13.2%之间。不同基质土壤中Cd和Pb元素的检出限(LOD)变化不明显,测量结果均与配制浓度吻合。结果表...     

液相色谱-串联质谱法测定甘蔗中10种除草剂的残留量

甘蔗样品(2.00g)用乙腈10.0mL匀质提取,提取液经QuEchERS方法净化。所得净化液进行液相分离,以Hypersil Gold色谱柱为分离柱,以不同体积比的含0.1%(体积分数)甲酸的10mmol·L~(-1)乙酸铵溶液和乙腈的混合液为流动相进行梯度洗脱,质谱分析中采用电喷雾正离子源选择反应监测模式检测。10种除草剂的质量浓度均在10~1 000μg·L~(-1)内与其对应的峰面积呈线性关系,方法的测定下限(10S/N)在2~10μg·kg~(-1)之间。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率在82.3%~120%之间,测定值的相对标准偏差(n=6)在3.9%~8.2%之间。     

微波消解样品-电感耦合等离子体原子发射光谱法测定植物中9种必需元素

植物样品置于聚四氟乙烯罐中,加入硝酸及过氧化氢后在MARS 5微波消解仪中按设定程序加热消解.样品溶液经定容为一定体积并保持一致的稀硝酸酸度,直接进样进行电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)分析,在选定的优化分析条件下同时测定其9种元素(钾、钙、镁、磷、硼、锌、铜、铁及锰)的含量.包括样品消解在内,分析全过程只需3～4 h.用标准曲线法进行定量,所得各元素的标准曲线均有良好的线性关系.应用此方法分析了一种茶叶标准物质(GBW 07605),所得9种元素的测定结果与证书值相符,各元素测定值的相对标准偏差(n=5)在0.3%～4.7%之间.     

未修饰的纳米金结合等位特异性扩增来检测K-ras基因点突变

将等位基因特异性扩增的特异性与纳米金特殊的光学性质相结合, 发展了一种新的基因点突变检测方法. 以肿瘤中常见的K-ras癌基因第12位密码子作为点突变检测对象, 采用突变型引物对待测序列进行等位特异性扩增. 突变型样品扩增产物中大部分是双链DNA; 而野生型样品由于不能被顺利扩增, 产物中大部分是单链DNA. 以纳米金颗粒作为报告基团, 向两种不同基因型扩增产物中依次加入纳米金胶和盐溶液, 野生型基因扩增产物中的单链引物被吸附到纳米金颗粒表面, 使得纳米金在适宜浓度的盐溶液中不发生聚集; 突变型样品扩增产物中的双链DNA由于与纳米金颗粒间存在静电斥力而不能被吸附到纳米金颗粒表面, 纳米金在该浓度的盐溶液中发生聚集, 导致两种基因型的混合液在吸收光谱和颜色方面均存在显著差异, 从而实现了检测基因点突变的目的. 该检测方法直观、快速、简便, 实验成本低, 能够检测到pmol量级的样品, 为点突变检测提供了一种实用的新方法.     

基于多肽标记物分析的肉制品掺伪定量检测技术

该文开发了一种基于多肽标记物分析的肉制品掺伪检测技术,可同时进行定性和定量分析。样品经蛋白质提取和胰蛋白酶消化后,采用高分辨质谱(HRMS)和生物信息学工具,寻找牛、鸡、鸭、猪和羊5种肉类的特异性热稳定多肽标记物。在多反应监测(MRM)模式下,通过高效液相色谱-串联四极杆质谱(HPLC-QQQ-MS)对这些标记物进一步验证。使用由两种不同质量分数的肉类混合物(0%~100%)建立定量校准曲线,测定低限可达1%。采用该方法对市售的实际样品进行测试,验证结果表明该方法是一种可靠、有效的肉制品鉴定手段,可同时用于生肉和熟肉掺伪的定量检测。     

气相色谱和气相色谱-质谱法测定食品中乙草胺残留

建立了气相色谱和气相色谱-质谱法检测10种植物源性和动物源性食品中乙草胺残留量检测方法.粮谷类和动物源性样品采用乙腈提取,GPC结合硅胶固相萃取柱净化;蔬菜类样品采用乙酸乙酯提取、硅胶固相萃取柱净化;元葱等样品先进行微波消解,然后采用乙酸乙酯提取,硅胶固相萃取柱净化.气相色谱和气相色谱-质谱联用法检测.两种方法检出限均为0.004 mg/kg; 在0.01～0.16 mg/L范围内均呈良好的线性关系,相关系数为0.9998和0.9997;在0.01、0.02和0.05 mg/kg的添加水平下,添加回收率在70%～102%之间;相对标准偏差(RSD)均小于10%.     

高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉产品中金刚烷胺残留量

应用高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉产品中金刚烷胺的残留量。样品经乙腈提取,以乙腈-水(3+7)溶液作为定容溶液。Phenomenex Kinetex C18色谱柱为分离柱,以不同体积比的0.1%(体积分数)甲酸溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾正离子源选择反应监测模式检测。采用基质匹配曲线校正。金刚烷胺的质量浓度在0.005~0.1mg·L-1范围内与其峰面积呈线性关系,检出限(3S/N)为1.0μg·kg-1。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率在82.5%~94.0%之间,测定值的相对标准偏差(n=6)在6.3%~11%之间。     

高效液相色谱法附蒸发光散射检测器同时测定烟用接装纸中7种甜味剂的含量

取接装纸样品剪碎成5mm×5mm的小片,称取2.000 0g用水20mL摇床振荡萃取35min,所得萃取液经0.22μm滤膜过滤,取其滤液进行高效液相色谱分析,用蒸发光散射检测器检测。选用ZORBAX SB C18色谱柱为固定相,进样量为10μL。用不同比例的(A)甲醇(每升中含三氟乙酸0.1mL,pH 4.5)和(B)水的混合液作为流动相进行梯度洗脱。在此条件下,所测定的7种甜味剂可达到有效的分离。以7种甜味剂所给出的峰面积对其相应的质量浓度绘制标准曲线,其线性范围均在75～400mg·L~(-1)之间,其检出限(3s)在0.65～9.06mg·L~(-1)之间。在已知样品的基础上加入3个浓度水平的标准溶液后,按试验方法进行回收试验,测得其回收率在89.9%～115%之间,测定值的相对标准偏差(n=5)在0.35%～2.3%之间。     

固相支撑液液萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定血中欧夹竹桃苷和欧夹竹桃苷乙的含量

采用高效液相色谱-串联质谱法测定血中欧夹竹桃苷和欧夹竹桃苷乙的含量。血液样品在固相支撑液液萃取柱上分散及固定后,用乙酸乙酯进行洗脱。所得洗脱液用于色谱分离,以Kinetex C_(18)色谱柱为分离柱,以不同体积比的含0.1%(体积分数)甲酸的10mmol·L~(-1)甲酸铵溶液和乙腈所组成的混合液为流动相进行梯度洗脱。在串联质谱分析中,采用电喷雾正离子源多反应监测模式检测。欧夹竹桃苷和欧夹竹桃苷乙的质量浓度均在2~100μg·L~(-1)内与其峰面积呈线性关系,方法的检出限(3S/N)均为0.5μg·L~(-1)。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率在90.0%~98.0%之间,测定值的相对标准偏差(n=6)在2.1%~7.3%之间。     

液相色谱-串联质谱法测定发泡聚苯乙烯餐具中8种荧光增白剂的含量

采用液相色谱-串联质谱法测定发泡聚苯乙烯餐具中FWA135、FWA184、FWA185、FWA199、FWA367、FWA368、FWA378、FWA393等8种荧光增白剂的含量。样品以三氯甲烷提取,加入甲醇使聚合物沉淀。在液相分离中,所得经过滤后的提取液,以Eclipse Plus C18色谱柱为分离柱,以不同体积比的0.1%(体积分数)甲酸-水溶液和0.1%(体积分数)甲酸甲醇溶液的混合液为流动相进行梯度洗脱。质谱测定中,采用电喷雾正离子源多反应监测模式检测。8种荧光增白剂的线性范围均为1.00~250μg·L~(-1),检出限(3S/N)在0.5~2.0μg·L~(-1)之间。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率在85.2%~98.4%之间,测定值的相对标准偏差(n=6)在4.1%~8.3%之间。     

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统将核酸提取、PCR扩增与实时荧光检测进行整合,在同一块微流控芯片上实现了核酸分析过程的全自动和全封闭,具有试剂用量少、分析速度快、操作简便等优点。本研究采用微机械加工技术制作集成核酸提取微流控芯片的阳极模,使用组合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片,与玻璃基底通过等离子体键合封装成集成核酸提取芯片。构建了由微流体速度可调节(0~10 mL/min)的驱动控制装置、温控精度可达0.1℃的TEC温控平台、CCD检测功能模块等组成的微全分析系统。以人类血液裂解液为样品,采用硅胶膜进行芯片上核酸提取。系统根据设置好的时序自动执行,以2 mL/min的流体驱动速度完成20μL裂解液上样、清洗;以1 mL/min的流体驱动速度完成DNA洗脱,抽取PCR试剂与之混合注入到反应腔。提取的基因组DNA以链上内参基因GAPDH为检测对象,并以传统手工提取为对照,在该系统平台上进行PCR扩增和熔解曲线分析实验。片上PCR扩增结果显示,扩增曲线明显,Ct值分别为25.3和26.9。扩增产物进行熔解曲线分析得到的熔解温度一致,均为89.9℃。结果表明,此系统能够自动化、全封闭的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR扩增与实时定量分析。     

基于DNA “Y”型结构的指数型核酸恒温扩增策略检测microRNA

该文基于“Y”型DNA模板和恒温指数扩增反应(EXPAR)技术的信号放大功能,建立了一种快速低序列依赖性的miRNA检测方法(Y-EXPAR)。以let-7b为检测目标,设计两条部分互补的DNA模板,与目标miRNA共同构成“Y”型结构,能够同时进行双向扩增,反应效率高,反应时间短,并降低了放大性能对模板序列的依赖。方法检出限低至0.3 amol/L(相当于10 μL溶液中有1.8拷贝的let-7b),并能区分单碱基差异的let-7家族同源序列。应用于肿瘤细胞裂解液let-7b的检测,POI值与细胞数目对数值呈线性关系,说明Y-EXPAR在实际样品miRNA的检测中具有优势。得益于扩增的高特异性、抗干扰性和低序列依赖性,该方法为miRNA的快速检测提供了新思路,在miRNA相关的疾病研究和临床诊断方面具有良好应用前景。     

基于杂交链式反应的适配体传感器用于卡那霉素的比色检测

基于醛基化磁珠颗粒(Aldehyde magnetic beads, AMBs)和DNA杂交链式反应(Hybridization chain reaction, HCR)的信号放大策略,设计了检测卡那霉素(Kanamycin, Kana)的比色适配体生物传感器(Aptasensor)。制备了Mbs@DNA复合物,其上的卡那霉素适配体链与卡那霉素发生特异识别后,释放出互补链,互补链含有设计好的引发序列,可作为信号探针,引发HCR反应,生成的双链DNA(Double-stranded DNA, dsDNA)表现出强负电性,与溶液中带负电金纳米颗粒(Goldnanoparticles, AuNPs)相互排斥,在高盐条件下,AuNPs的稳定性被破坏而发生聚集,导致溶液的颜色从红色变为紫色,吸收光谱也发生变化。本方法检测卡那霉素的线性范围为1.6～32.0 nmol/L,检出限为0.9 nmol/L(S/N=3);实际样品牛奶和蜂蜜样品中卡那霉素的加标回收率在96.0%～105.0%之间,相对标准偏差在3.3%～5.0%之间,说明本方法实用性良好。本方法对卡那霉素的检测具有较高的灵敏度和特异性,...     

二甲氧基硫代磷酸酯类农药多残留免疫分析方法研究

以二甲氧基硫代磷酸酯类农药为目标,设计合成了系列半抗原及抗原,制备了4种宽谱特异性抗体。研究结果表明,含不饱和烷烃手臂的半抗原所制备的抗体宽谱特异性优于含酰胺键手臂的半抗原所制备的抗体。采用目标待测物的特征次级结构作为包被半抗原可显著提高ELISA检测灵敏度。经条件优化建立的最佳间接竞争ELISA多残留检测方法可同时检测8种常用高毒农药,其检出限(LOD)在2.6～104μg/kg之间,符合相关限量标准要求。生菜样品药物添加平均回收率为73.9%～121.4%;平均相对标准偏差为10.6%～18.4%。菜心样品药物添加平均回收率为80.4%～121.2%;平均相对标准偏差为13.5%～24.4%。方法精密度均达到气相色谱法的检测水平。     

气相色谱法测定汽车表面涂装的12种挥发性有机物含量

采用气相色谱法测定汽车表面涂装的12种挥发性有机物的含量。样品中的挥发性有机物(VOCs)经活性炭富集,二硫化碳解析后,用DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm,0.25μm)分离,火焰离子化检测器检测。12种挥发性有机物的质量浓度均在1.00~100mg·L~(-1)范围内与其峰面积呈线性关系,方法的检出限在0.012~0.100mg·m~(-3)之间。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率在67.0%~107%之间,测定值的相对标准偏差(n=6)在1.8%~8.6%之间。     

气相色谱法测定修正类产品中10种苯类溶剂残留量

采用气相色谱法测定修正类产品中10种苯类溶剂的残留量。修正类产品样品用乙酸乙酯超声提取30min,用DB-WAX毛细管色谱柱(30m×0.32mm,0.25μm)分离,火焰离子化检测器检测。10种化合物的质量浓度均在0.20~100.0mg·L-1范围内与其信号强度呈线性关系,方法的测定下限(10S/N)在1.8~2.1mg·kg-1之间。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率在90.3%~113%之间,测定值的相对标准偏差(n=6)在1.8%~6.1%之间。     

固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水中13种抗生素的含量

采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水中13种抗生素的含量。水样中的抗生素富集于PLS固相萃取柱上,用甲醇洗脱,洗脱液进行LC分离,以Endeavorsil C18色谱柱为分离柱,以不同体积比的0.4%(体积分数)甲酸-水溶液和甲醇-乙腈(40+60)溶液的混合液为流动相进行梯度洗脱。质谱分析中,采用电喷雾正离子源多反应监测模式检测。13种抗生素均在一定的质量浓度范围内与其对应的峰面积呈线性关系,方法的检出限(3S/N)在0.4~1.5ng·L~(-1)之间。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率在70.4%~101%之间,测定值的相对标准偏差(n=5)在1.1%~4.8%之间。     

液相色谱-串联质谱法测定水产品中磺胺类及喹诺酮类药物残留量

水产品样品(5.00g)经乙腈-甲酸(99+1)混合液20mL提取,无水乙醇除水,浓缩并加正己烷2mL脱脂。所得溶液进行液相色谱分离。以ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱为分离柱,以不同体积比的甲醇和0.1%(体积分数)甲酸溶液的混合液为流动相进行梯度洗脱。质谱分析中,采用电喷雾正离子源多反应监测模式检测。采用内标法定量。所涉11种药物的线性范围均为5~200μg·L~(-1),方法的测定下限(10S/N)在0.07~0.20μg·kg~(-1)之间。在1.0,4.0,20.0μg·kg-1等3个浓度水平进行加标回收试验,回收率在80.3%~119%之间,测定值的相对标准偏差(n=6)在1.3%~12%之间。