HCVNS2基因表达载体的构建及在E.coli中表达

PCR人含有丙肝病毒全长非结构蛋白的载体pBlueBac25中扩增出全长的NS2基因DNA片段,分别克隆到表达载体pQE30和转座载体pFasBacHTb的多隆位点（MCS）,PFastNS2通过转座插入穿梭载体Bacmid的表达盒;pQENS2转化JM109菌株,诱导表达出N端含有6个His的全长His的全长NS2蛋白,用Ni-NTA-agarose柱层纯化,获得提纯的全长NS2蛋白。     

丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达

将含有丙型肝炎病毒（HCV）NS5B基因的转移载体pBlueBac5B与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染Sf9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5B基因的重组病毒AcNS5B.提取重组病毒基因组DNA进行Southern分析,发现有一条1.8kb的DNA片段与标记的探针发生杂交.AcNS5B感染Sf9细胞后,在细胞中表达了分子量为66×103的蛋白,用Westernblot方法检查这种蛋白质,能与兔抗HCVNS5B抗血清发生特异的强烈反应.     

猪瘟病毒NS3蛋白的原核表达纯化和抗体制备

以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.     

环状RNA在内分泌与代谢疾病中的研究进展

环状RNA是一种新兴的具有闭合环状结构的内源性非编码RNA, 主要由前体RNA通过可变剪切加工形成的闭合环状RNA分子, 不具有5’端帽子和3’端polyA尾巴结构. 目前研究认为环状RNA具有丰度显著增高、结构稳定、发育阶段特异性表达和物种间保守性等特征, 说明circRNA在基因表达方面有重要的调控作用. 近年来, 研究发现circRNA在肿瘤、糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管系统疾病以及神经紊乱等疾病的发生发展中起着重要的作用, 尤其在内分泌与代谢疾病的发生发展中扮演了重要角色. 因此环状RNA作为新的生物标志物, 为疾病的诊断和治疗提供了新的思路. 本文对环状RNA的结构功能与内分泌代谢疾病的关联以及其潜在临床价值进行了综述.     

Taura 综合征病毒主要结构蛋白的表达与纯化

根据Taura综合征病毒(TSV)基因组,设计特异性引物,从感染病毒组织中提取组织总RNA后扩增,分别将3个主要结构蛋白基因VP1、VP2和VP3克隆到pGEM TEasyVector.与表达载体连接后,导入大肠杆菌中诱导表达,并纯化目的蛋白.诱导表达的融合蛋白分子量分别为54.2×103、43×103和57.1×103,在变性条件下过柱纯化VP1和VP2,一次可以纯化10mg以上纯度较高的蛋白.     

人t-PA P区在大肠杆菌中表达及其活性研究

用PCR方法获得编码人组织型纤溶酶原激活物（tissure-typeplasminogenactivator,t-PA）C端P区肽段的DNA,并经测序证实,长810bp,含有全部的t-PA的丝氨酸蛋白酶编码序列.将这段序列克隆到表达载体pQE30中转化大肠杆菌JM109菌株,经SDS-PAGE检测转化菌株中表达出分子量约29×103的蛋白,用纤维平板法测定激活纤溶活性,结果表明表达的t-PA蛋白C端P区具有很强的激活纤溶蛋白酶原的活性.证实t-PA蛋白C端P区的酶结构区的功能是独立的,其生物活性不受其它区域影响．     

人泡沫反转录病毒(HSRV)的研究进展

扼要介绍了近年来人泡沫反转录病毒(HSRV)研究的进展,包括病毒形态、基因组结构、病毒蛋白质及其转录特性,并对HSRV与疾病的关系和HSRV构建反转录病毒载体的基础进行了分析.     

鸭源H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆、序列分析及原核表达

参照GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计并合成引物,以鸭源H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,利用RT PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18 T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子.测序结果表明HA基因长为1683bp.基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX KG中,与GST融合表达.SDS PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量约为90×103.Western印迹表明表达蛋白具有免疫活性.     

一种适合提取新疆哈密瓜病毒总RNA的氯化锂沉淀法

哈密瓜是新疆最重要的经济作物之一,新疆哈密瓜受到病毒病较为严重的为害.本研究优化建立了一种经济简便,适合提取和保存哈密瓜病毒总RNA的氯化锂沉淀法.利用本文的氯化锂沉淀法,提取了来自新疆多个哈密瓜主栽区和多个哈密瓜品种的病毒病样品的总RNA.试验结果表明,提取的总RNA能满足哈密瓜病毒大规模田间样品分子检测的需求.本研究为哈密瓜病毒总RNA的提取提供了一种经济简便的方法,从而为新疆哈密瓜病毒大规模田间样品的分子检测和哈密瓜病毒病的防控提供了一定的技术支撑.     

贝莱斯芽孢杆菌SW5菌株与外源蛋白酶协同发酵对鳀鱼鱼露品质的影响

为进一步研究接种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) SW5菌株对发酵鳀鱼鱼露品质的影响,以低值鳀鱼为原料,通过接种贝莱斯芽孢杆菌SW5菌株,并添加多种蛋白酶协同发酵鳀鱼鱼露.测定氨基酸态氮(AA-N)质量浓度、pH值和总酸质量浓度的变化,采用电子舌和色差仪测定鱼露发酵完成后发酵液的鲜味成分含量和色泽,与商品鱼露和酶解液进行对比.结果表明在发酵过程中,采用贝莱斯芽孢杆菌SW5菌株与中性蛋白酶协同发酵,发酵第7天AA-N质量浓度达到最高,为13.93 g·L^-1,符合市售一级鱼露标准.3个处理组的色泽和鲜味成分含量与商品鱼露相近.综上所述,通过接种贝莱斯芽孢杆菌SW5菌株和蛋白酶对鳀鱼鱼露进行协同发酵可以缩短发酵周期,提高鱼露的产量以及AA-N和鲜味成分的含量.因此,该菌株可用作海洋蛋白源物质的发酵深加工.     

超分支滚环试纸检测虾传染性皮下及造血组织坏死病毒

依据传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)的非结构蛋白NS1基因序列,设计特异的锁式探针,建立IHHNV病毒超分支滚环扩增(hyper-branched rolling circle amplification,HRCA)检测方法并构建试纸条.结果表明,IHHNV HRCA试纸的检测限可以达到10拷贝/μL,较常规PCR法高约2个数量级,且能够保证对IHHNV的特异性检测.利用该试纸条对国产与进口的42份虾样本进行IHHNV检测,结果显示,HRCA试纸条在灵敏度上优于常规PCR,且方法直观、更易于结果判定.     

马尾松毛虫CPV基因组第7片段的cDNA克隆及序列分析

利用琼脂糖凝胶电泳分离马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)基因组dsRNA,并回收纯化第7片段(S7).经逆转录和PCR扩增,获得2个亚克隆片段并测序.再根据已测序列设计引物,利用RNA连接酶介导的RACE法得到S7两端克隆并测序.通过拼接可得到DpCPVS7全序列.经过序列分析发现,S7全长1502bp,5′端具有CPV 1型末端保守序列AGTAA,3′端具有保守序列GTTAGCC.起始密码子ATG位于25～27残基,终止密码子TAG位于1373～1375残基,推测S7片段编码448个氨基酸多肽,分子量约为5.0×107.与舞毒蛾质型多角体病毒(LdCPV 1)和家蚕质型多角体病毒(BmCPV)第7片段相比较,核苷酸同源性分别为99%和86%.     

山茱萸的大孢子发生和雌配子体发育

本文对山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)的大孢子发生和雌配子体发育进行了研究,并用组织化学方法对胚珠组织中的RNA、DNA、蛋白质和不溶性多糖进行了测定观察.山茱萸的胚珠为单珠被、薄珠心,并在发育过程中形成结构特殊的珠被绒毡层、承珠盘和珠孔塞.孢原细胞直接起大孢子母细胞作用.合点端大孢子具功能.胚囊发育属寥型.在开花前2个月时,成熟胚囊中的2个极核融合次生核,3个反足细胞退化,形成由一个3-细胞卵器和一个具次生核的中央细胞构成的4-细胞雌配子体.某些助细胞中的核位于近合点端,珠孔端为大液泡所占据,次生核通常位于胚囊的合点端.对珠被细胞的RNA、DNA、蛋白质和不溶性多糖的染色均呈较强的正反应.在成熟后期的珠被各层细胞中,除多糖颗粒外,对其他几种物质的检测结果均表现出由外向内形成一个较明显的浓度梯度,即珠被绒毡层着色最深.在成熟的雌配子体中,以卵细胞对Brachet反应最强,其次是中央细胞.卵细胞含大量淀粉粒,助细胞和中央细胞含淀粉粒少,且颗粒比卵细胞中的小.卵细胞和中央细胞呈Feulgen负反应.     

山茱萸的大抱子发生和雌配子体发育

本文对山茱芙(Corpus of ficinalis Sieb. et Zucc.)的大抱子发生和雌配子体发育进行了研究,并用组织化学方法对胚珠组织中的RNA, DNA、蛋白质和不溶性多糖进行了测定观察. 山茱英的胚珠为单珠被、薄珠心,并在发育过程中形成结构特殊的珠被绒毡层、承珠盘和珠孔塞.泡原细胞直接起大泡子母细胞作用.合点端大袍子具功能.胚囊发育属寥型.在开花前2个月时,成熟胚囊中的2个极核融合次生核,3个反足细胞退化,形成由一个3一细胞卵器和一个具次生核的中央细胞构成的4一细胞雌配子体.某些助细胞中的核位于近合点端,珠孔端为大液泡所占据,次生核通常位于胚囊的合点端. 对珠被细胞的RNA, DNA、蛋白质和不溶性多糖的染色均呈较强的正反应.在成熟后期的珠被各层细胞中,除多糖颗粒外,对其他几种物质的检测结果均表现出由外向内形成一个较明显的浓度样度,即珠被绒毡层着色最深.在成熟的雌配子体中,以卵细胞对Brachet反应最强,其次是中央细胞.卵细胞含大量淀粉粒,助细胞和中央细胞含淀粉粒少,且颗粒比卵细胞中的小卵细胞和中央细胞呈Feulgen负反应.     

对虾白斑综合征病毒VP28免疫后克氏原螯虾血清酶活性及中和活性

利用原核表达的对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)结构蛋白VP28口服免疫克氏原螯虾,以酚氧化酶和溶菌酶指标来监测机体的免疫反应,并检测免疫后的螯虾血清对WSSV的中和能力.结果表明VP28能有效激起机体的免疫反应,酚氧化酶活性始终处于较低的水平,低于GST对照组和健康组,溶菌酶活性则高于GST对照组和健康组.中和实验表明免疫血清具有一定的中和活性,但其保护作用不是通过VP28进入体内与细胞受体结合,来阻止病毒进入,而可能是通过病毒蛋白进入虾体后刺激机体产生或分泌某种中和因子,从而阻止病毒进入细胞或进入细胞后阻止进一步传播.     

1,3,4-噻二唑衍生物的合成及初步活性测定

以对位取代苯甲酸与氨基硫脲为原料在三氯氧磷的条件下脱水,合成一系列5-芳基-2-氨基-1,3,4-噻二唑衍生物.合成的化合物经过IR、MS和1H-NMR结构表征.这些化合物在体外对氨肽酶N和基质金属蛋白酶显示了良好的抑制活性,可以作为先导化合物进行结构改造,为进一步研究蛋白酶抑制剂提供了新的方向.     

人乙醇脱氢酶ADH1B2在毕赤酵母中的表达及活性分析

根据GeneBank中人乙醇脱氢酶ADH1B2基因序列设计引物,以人肝脏总RNA为模板,反转录获得人乙醇脱氢酶基因.将克隆基因与表达载体pPICZB连接,测序正确的pPICZB-ADH1B2电转化毕赤酵母GS115;重组毕赤酵母工程菌经0.5%（v/v）甲醇诱导72 h后目的蛋白以可溶形式表达,经DEAE-Sepharose FF纯化后蛋白酶活性可达8 000 U·mg^-1.同时构建重组质粒pCDNA3.1-ADH1B2转染HepG2人肝癌细胞,发现细胞内ROS/GSH水平降低,Akt磷酸化水平降低,细胞活性下降.为临床酒精中毒预防和治疗药物的研发以及ADH在肝脏肿瘤方面的研究提供了理论基础.     

猪瘟病毒基因表达水平与同义密码子使用频率的关系

用信息类聚方法研究了猪瘟病毒基因表达水平与同义密码子使用频率的关系，求出了猪瘟病毒基因组各同义密码子的相对使用频率，得到了作为表征基因表达水平的各类基因的信息熵，所得结果与已有的研究结论相符．本研究表明：对于猪瘟病毒的单股正链RNA结构，同义密码子的使用频率对于基因表达水平有重要影响．     

虹鳟腺苷酸转移酶基因2(ant2)cDNA克隆与蛋白结构分析

腺苷酸转移酶(ANT)是位于线粒体内膜上参与能量分子传导的转运蛋白,在细胞凋亡调控网络中发挥重要作用.以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟鱼ant2基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ591153).该序列全长1276 bp,其中5'端非翻译区长66 bp,3'端非翻译区长316 bp,开放性阅读框长894 bp,编码297个氨基酸.该蛋白具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域和3个转膜区.通过与其他脊椎动物腺苷酸转移酶蛋白序列的比较,发现该基因具有高度保守性,氨基酸序列的同源性均在90%左右.同源模建显示其与牛的线粒体ADP/ATP载体,chain A蛋白有相同的孔洞(cavity)结构.     

草鱼出血病病原病毒在鱼类细胞中增殖的研究

应用电子显微镜和放射自显影术,观察草鱼出血病两种病原病毒——草鱼呼肠孤病毒(GCR)和草鱼小RNA病毒(GCP)在鱼类细胞中的形态及增殖过程的一些重要特征。着重描述GCR从“毒浆结构”发生和GCP的特殊装配形式以及两者RNA在细胞中的复制部位和转移过程,也对两种病毒的形态发生动态、释放形式与宿主细胞的病变效应作了观察和讨论。