小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能研究

用免疫外科法从小鼠孤雌生殖胚胎分离胚胎干细胞,并研究了其在体内、体外的分化潜能．结果发现:从小鼠孤雌生殖的胚胎中可分离出胚胎干细胞(pES),可以传代培养25代,能表达很强的碱性磷酸酶,核型稳定呈40XX．培养至第18代的pES在体内可诱导肿瘤形成,并可分化为三个胚层的组织细胞．免疫组化结果显示:神经细胞特异性烯醇化酶（NSE）、肌肉特异性肌动蛋白?-actin均呈阳性,表明分离培养的pES在体内可至少分化为来自外胚层和中胚层的组织细胞．传至第20～24代的pES细胞,经体外定向诱导分化,可定向分化为节律性收缩的心肌细胞及神经细胞．免疫组化检测显示节律性收缩的心肌细胞表达?-actin,而神经细胞表达NSE．结果表明:利用免疫外科法可从孤雌生殖的小鼠胚胎建立pES,这些pES在体内、体外都具有分化为多种类型细胞的潜能．     

昆明鼠胚胎干细胞的分离培养与鉴定

目的：从昆明系小鼠的早期胚胎分离和培养胚胎干细胞(ES细胞)．方法：收集小鼠3．5d胚龄的囊胚，将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，5—6d后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养，观察集落的生长情况并通过碱性磷酸酶染色、原位杂交、细胞核型分析等对细胞集落进行鉴定．结果：KS细胞集落性生长，符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性．结论：昆明系小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可以发育成ES细胞，并能进行传代培养．     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养

目的探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养。方法取BALB/c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对MEF的生长形态进行观察,并对传代细胞培养液、胚胎胎龄、胰蛋白酶浓度进行筛选。结果 MEF在体外为贴壁生长型细胞,第三、四、五代细胞纯度较高且增殖最为旺盛;添加血清的M199和DMEM均能较好的满足原代细胞的生长,两种培养液中细胞增殖的速度无明显差异;11.5～16.5d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果最好;0.1%胰蛋白酶消化MEF时间以8～11min为宜。结论通过对MEF分离培养影响因素的筛选,为MEF的进一步研究奠定了基础。     

小鼠附睾精子的显微受精

目的：建立显微受精的方法,并探讨小鼠附睾精子在显微注射进入卵母细胞后的受精能力。方法：用显微注射法把小鼠附睾头和附睾尾精子注入卵母细胞的胞质内或卵周隙进行显微受精。结果：把单个附睾尾精子注入卵细胞质中,培养后１４个存活的卵细胞中,有５个卵裂为２－细胞期胚胎;将单个附睾头精子注入卵母细胞中,有２５个存活,其中９个受精发育为２－细胞期胚胎;将附睾尾精子注入卵周隙进行带下受精,３０个存活的卵细胞中有４个     

小鼠胚胎干细胞建系新方法的初步研究

通过对小鼠胚胎着床初期子宫组织块的培养及内细胞团的分离，探讨利用该方法获得胚胎干细胞的可能性，我们用这种方法已建立了一株小鼠胚胎干细胞系，传至第10代，AKP染色细胞呈强阳性，RT—PCR证实Qct-4表达强阳性。结果表明，利用这种方法获得胚胎干细胞是可行的，与传统方法相比，这种新方法极大简化了实验步骤，降低了实验技术难度。     

小鼠胎儿成纤维细胞的冷冻保存研究

为了摸索小鼠胎儿成纤维细胞冷冻保存的简易方法,采用常规冷冻和玻璃化冷冻2种模式,探讨了不同的冷冻方法、不同的冷冻前平衡时间、不同的冷冻保护液的配比等因素对成纤维细胞冷冻效果的影响。实验结果表明:常规冷冻采用含10%(体积分数)甘油的DMEM液作保护剂,可将0~5℃下平衡时间缩短至45~60 min,细胞活力可达0.87。玻璃化冷冻采用10%(体积分数)NBS+1.8 mol/L乙二醇+0.1 mol/L蔗糖的PBS冷冻小鼠胎儿成纤维细胞效果好于其他组合,细胞活力可达到0.86。玻璃化冷冻法与常规冷冻法的冷冻效果差异不显著。     

小鼠胚胎干细胞对病毒性心肌炎的影响

目的使用小鼠验证这样一个假设:外界病毒浸入诱发心肌炎时,机体的干细胞将进入心脏提高心肌的抗病毒能力。方法雄性BALB/c小鼠分为三组:小鼠胚胎干细胞对照组(ES),心肌炎病毒组(EM CV)及EM-CV加ES治疗组。通过尾静脉注射,令小鼠立即感染病毒。小鼠死亡率,炎性细胞浸润及心肌坏死等为观察指征。干细胞的游走及分化等通过免疫荧光法来验证。结果给予干细胞后的小鼠的存活率明显高于生理盐水对照组,炎性细胞侵润及心肌坏死亦明显低于生理盐水对照组。免疫荧光法表明,干细胞进入心肌并分化成新的心肌细胞。结论干细胞能明显提高心肌炎小鼠的存活率,减少心肌组织的坏死。同时,亦证明当心脏遭受病毒的侵入后,干细胞通过某种机理修复或再生心肌细胞,从而提高组织的抗病毒能力。     

强力氨肽对小鼠成纤维细胞的影响

蛋白质对细胞合成和代谢有一定程度的影响,高浓度胺肽含有丰富的氨基酸,通过对实验组和对照组小鼠脸颊、腹部和四肢等部位皮下结缔组织的比较,实验组小鼠上述３ 个部位的成纤维细胞数量和直径与对照组相比均有显著差异,而且细胞外基质成分也比对照组发达实验证明强力氨肽具有促进成纤维细胞的分裂和合成能力,对伤口愈合增强皮下结缔组织的韧性和弹性具有显著作用     

用高代数小鼠胚胎干细胞制作嵌合体小鼠

为了检验胚胎干的全能性,通过用1日龄卵巢移植后,经体外受精得到的囊胚的饲养建立了小鼠的ES系,并在较高的代数下(第41代)制出了5只毛色嵌合体小鼠,但是没有得到性腺嵌合的小鼠。研究结果证实,高代数的ES细胞仍然具有构建嵌合体的能力。     

小鼠精原干细胞的体外培养与鉴定

建立一种简单、有效体外分离和培养精原干细胞（Spermatogonia stem cell,SSCs）的方法。采用酶消化6—8d新生小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液后进行培养,碱性磷酸酶（AKP）染色和间接免疫荧光对培养的细胞进行鉴定;结果显示：SSCs培养3～5天可观察到细胞克隆的产生,AKP染色强阳性;间接免疫荧光显示GCNF阴性,oct-4、c—kit均呈阳性反应。由此可知以DMEM＋15％胎牛血清＋白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）＋L-谷氨酰胺等为培养基,成功建立了精原干细胞的体外培养体系。     

精子和酒精对小鼠卵母细胞激活的比较

对不同卵龄的小鼠卵母细胞被精子和酒精激活后的激活率进行了比较。结果显示,卵母细胞对常规的体外受精和酒精的人工激活的激活率存在卵龄的差异。注射hCG后15～24h的卵母细胞容易被酒精的人工刺激所激活,20h卵龄的卵母细胞激活率最高,平均为81．6％,且速即卵裂率也最高,平均为48％,卵龄更大的卵母细胞激活率降低,而13h的卵母细胞难以被酒精激活。另一方面,13～15h的卵母细胞容易被精子激活而受精,卵龄较大的卵母细胞在体外难以被精子激活受精。这表明,精子和酒精对卵母细胞的激活机制有所不同。     

成年小鼠成纤维细胞体外培养

成年小鼠皮肤成纤维细胞可从尾部取材用组织块培养法进行原代培养,添加血清的M 199(E arle′s)和低糖的DM EM均能较好的满足原代细胞的生长.两种培养液中细胞增殖的速度无明显差异.用0.25%胰蛋白酶消化小鼠尾尖原代培养物,上皮细胞与成纤维细胞有明显的敏感度差别.经控温控时消化传代,可将上皮细胞与成纤维细胞分离纯化.     

克服昆明小鼠早胚2-细胞阻滞的研究

目的：评价两种培养液对昆明小鼠胚胎２－细胞阻滞的克服效果。方法：用添加１５％ＦＣＳ或ＢＳＡ的Ｍ１６和ＣＺＢ培养液培养昆明小鼠２－细胞胚胎和体外受精卵,以观察这两种培养液对昆明小鼠早胚发育的影响及在克服昆明小鼠２－细胞阻滞中的作用,并通过ＣＺＢ培养液中葡萄糖成份的增减,了解其作用及效应的时间。结果：添加ＦＣＳ的Ｍ１６和ＣＺＢ培养注均能较好地支持２－细胞胚胎发育到囊胚（７８．９％,７２．７％）,当进行     

四氯化碳对雌性小鼠卵母细胞成熟和体外受精等影响

探讨了四氯化碳对小鼠生殖作用的影响.采用小鼠卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了四氯化碳对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精的影响.结果表明:四氯化碳对小鼠脏器、超排卵的卵母细胞数量和卵母细胞生发泡破裂没有影响,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放,影响卵母细胞的存活率并可降低体外受精率.四氯化碳可以破坏卵母细胞减数分裂进行,降低卵母细胞的受精能力,具有潜在的生殖毒性.     

卵母细胞老化对小鼠体细胞克隆胚发育的影响

就小鼠卵母细胞的卵龄对克隆胚的体外发育能力的影响进行了检测,以确定最佳的取卵时间,以及取卵后进行核移植操作的可耐受的时间。采用PMSG和hCG超排B6D2F1雌鼠。在体内老化实验中,分别于注射hCG后13,15,17,20h取卵用于核移植操作;在体外老化实验中,所有的卵均于注射hCG后13h取出并培养,然后在13,15,17,20h进行核移植操作。每个时间点的核移植操作在1h内完成,重构的胚胎培养1h后进行激活。结果显示:在体内老化实验中,注射hCG后13h取卵,获得的克隆囊胚发育率最高,为56.0%,15h取卵仍维持了其支持胚胎体外发育的能力,但17h及更长时间后取的卵,重构后的囊胚发育率显著下降(18.1%)。注射hCG后15h取的卵孤雌发育率最高(囊胚发育率为90.1%),并在17h仍维持较高的孤雌发育能力,在20h显著下降。在体外老化试验中,于注射hCG后13h取卵,分别于13,15,17h重构,都获得了较高的囊胚发育率(分别为57.7%,52.2%,46.3%),而在注射hCG后20h重构,囊胚发育率显著下降(14.8%)。体外老化的孤雌胚在注射hCG后22h激活时囊胚发育率显著下降。结果表明:卵母细胞在体内和体外老化都影响克隆胚的体外发育,最佳取卵时间为注射hCG后13h,取卵后立即用于重构可获得最佳囊胚发育率;体内、外老化卵支持重构胚较好发育的时间间隔是不同的,体内老化卵支持重构胚发育能力从注射hCG后17h开始下降,体外老化卵则发生在20h。这些结果可以指导操作,有利于在应用核移植进行其他基础研究时降低操作引起的误差。     

牛体外受精卵发育培养条件的研究

将采自屠宰母牛卵巢的未成熟卵子在含有促进性腺激素和胎牛血清的TCM199培养基内培养成熟后,使用以钙离子载体Ionophore A23187诱导获能的牛精子进行授精处理.在受精卵发育用培养基中添加了谷氨酰胺,并以此与无添对照进行了对比,探索了培养基内谷氨酰胺的存在与否对胚胎发育的影响.另外,在发育用培养基内还分别添加了胎牛血清(FCS),阉牛血清(NSS)以及发情母牛血清(OCS)以观察其培养效果,结果表明,谷氨酰胺对胚胎的发育有极大的促进作用,添加谷氨酰胺的处理组与对照组中发育为桑椹胚、囊胚的胚胎比例分别为23.4%和6.6%,具有极显著的整异.而在含有FCS、NSS和OCS的TCM199培养基内培养的卵子中分别有81.4%,70.7%和82.9%发育为二细胞期胚胎,将胚胎继续培养至授精后第8天时,三个处理组中发育为桑椹胚、囊胚的胚胎比例分别为30.0%,40.2%和47.1%,以OCS的培养效果为最佳.本研究的结果证明,谷氨酰胺和发情母牛血清对牛体外受精卵的体外发育具有良好的促进作用.     

昆明小鼠体外受精卵体外发育的研究

分别以TYH和T_6为受精用培养液,将昆明小鼠附睾精子获能培养1小时后与超排卵子进行授精,受精率分别为70.2%和65.3%.将体外受精卵分别在Whitten,Whitten 输卵管上皮,Whitten 输卵管上皮 EDTA,TCM199,TCM199 输卵管上皮和TCM199 输卵管上皮 EDTA中进行培养,授精后24,48,72小时观察发育情况,结果Whitten和TCM199以及分别在其内添加输卵管上皮不能维待2细胞胚的进一步发育;当在Whitten和TCM199中分别同时加入输卵管上皮和EDTA时,2细胞、4细胞胚的发生率明显高于其它四种处理组,且分别有84.1%和81.6%的2细胞胚可克服2细胞阻滞,发育至桑椹胚.     

一种简易小鼠原代肝细胞分离方法

对小鼠原代肝细胞分离方法进行改良,通过简单且经济的方法获得小鼠原代肝细胞,采用4.5号输液针经下腔静脉逆行灌流,用长条状纸板对针进行固定,以获取质量稳定的小鼠原代肝细胞悬液.结果显示,改进后的方法灌流成功率高及重现性好并可获得实验所需肝细胞,细胞对台盼蓝拒染率90%.方法操作简单,成本较低且效率较高.