3′-末端氧化的tRNA~(Leu)对大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶的亲和标记

本文用3′-末端氧化的tRNA~(Leu)(tRNA_(ox)~(Leu))专一地标记了大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)。合成酶标记上等摩尔tRNA_(ox)~(Leu)后,氨酰化活力完全丧失,同时氨基酸活化活力也失去80％。这样失活反应是通过tRNA_(ox)~(Leu)的3′-末端羰基与亮氨酰-tRNA合成酶活性中心或其附近的赖氨酸残基的ε-氨基形成Schiff碱实现的。Schiff碱经硼氢氰化钠还原后稳定。酶与tRNA_(ox)~(Leu)的共价复合物经牛胰核糖核酸酶充分水解后,其活化氨基酸的活力及动力学常数基本恢复到原来水平,而氨基酰化活力未恢复。表明了该合成酶的两种活性中心相互关联又有区别。     

tRNA分子中修饰核苷酸的生物功能——Ⅲ.酵母tRNA类似物(A_(37),G_(37)或C_(37)代替m~1I_(37))的合成及生物活性

本文报道用牛脾磷酸二酯酶在控制条件下制备了去除37位m~(?)I的酵母丙氨酸tRNA3′-半分子(38—76核苷酸)。合成了由普通碱基A,G或C代替m~(?)I_(37)的酵母丙氨酸tRNA类似物。并测定了这些类似物的生物活性,结果表明与天然的酵母丙氨酸tRNA相比,这些类似物在鼠肝tRNA合成酶系统中接受丙氮酸的活力不受影响,而在兔网织蛋白质合成系统中携带丙氨酸参入蛋白质的活力却下降为天然tRNA的20—30％,对上述结果及牛脾磷酸二酯酶的作用条件进行了讨论。     

酵母丙氨酸tRNA类似物的合成及其生物活力的测定

在体外系统中,T 7-RNA聚合酶转录编码酵母丙氨酸tRNA及其半分子的DNA,获得不含修饰核苷酸的酵母丙氨酸tRNA及其5’半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸).在T4-RNA连接酶的催化下,不含修饰核苷酸的5'半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸)分别与天然的3'半分子(36-75位核苷酸)和5'半分子(1-36位核苷酸)连接成tRNA类似物.用以上方法得到了酵母丙氨酸tRNA的3个类似物:(1)tRNA的5'半分子不含修饰核苷酸;(2)tRNA的3'半分子不含修饰核苷酸;(3)整个tRNA分子不含有修饰核苷酸.在鼠肝氨酰tRNA合成酶系统中测定tRNA接受丙氨酸的活力,在兔网质无细胞蛋白质合成系统中测定tRNA将丙氨酸参入蛋白质的活力.结果是:5'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低52％,而参入丙氨酸的活力基本不变;3'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低79％,参入活力降低57％;整个分子不含修饰核苷酸者接受丙氨酸的活力降低85％,参入活力降低47％.这些结果说明修饰核苷酸,尤其是3'半分子的修饰核苷酸与tRNA的接受活力和参入活力间有密切的关系.     

抗体催化的氨酰化反应

酰基转移反应在许多生物学或化学过程中都起着十分重要的作用。氨酰tRNA合成酶在蛋白质生物合成中起关键作用。它催化tRNA的终端腺苷上2′,3′-二醇的酯化反应。伯克利化学系的Schultz小组最近提出这样一个问题,能否产生催化这类反应的抗体。这样的抗体也许会加速tRNA与新氨基酸的氨酰化,可用于蛋白质的生物合成研究。他们发现,针对磷酸二酯过渡态类似物产生的一种     

亮氨酰-tRNA合成酶的限制性酶解及活性片段的研究

大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)经胰蛋白酶限制性酶解,被切去约6k分子量肽段,产生一96k片段。该片段具有与天然酶相同的氨基酸活化反应的动力学常数,但丧失氨酰化活性、tRNA~(Leu)结合活性等由tRNAL~(Leu)参与的一系列活性。N-末端分析表明切去的6k肽段系LeuRS C端部分,该部分是LeuRS结合tRNAL~(Leu)所必需的。本文表明LeuRS的氨基酸活化和氨酰化这两种活性是相互独立并分别处于酶分子不同的结构域。LeuRS C端部分可能是tRNA~(Leu)的结合部分。     

微波辐射高效共价固定青霉素酰化酶

为提高青霉素酰化酶的共价固定化效率, 在微波辐射条件下将酶蛋白共价固定于介孔泡沫硅(MCFs)的孔道中. 通过正硅酸四乙酯水解缩合制备介孔泡沫硅, 再于微波辅助下将青霉素酰化酶共价固定在其孔道中. 以固定化酶相对活力和活力回收为指标, 考察了加酶量、固定化温度、微波辐射时间等条件对酶固定化效率的影响. 实验结果表明: 当加酶量为60 mg/g, 固定化温度为20 ℃, 微波辐射140 s, 固定化酶相对活力达到178.1%, 表观活力为1191.3 U/g(以湿重计). 与常规方法相比, 微波辅助固定化酶时, 固定化酶相对活力提高34.5%, 固定化时间亦大幅缩短至数分钟, 这为青霉素酰化酶的高效共价固定化提供了一条新的途径.     

稀土离子对大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶动力学性质的影响

采用含ｐＴｒｅ－９９Ｂ／ｌｅｕＳ２转化子的高表达菌株,简便快速地提取、纯化大肠杆菌亮氨酰－ｔＲＮＡ｜＾ｅｕ与未脱镁ｔＲＮＡ｜＾ｅｕ对ＡＴＰ和亮 酸的表观Ｋｍ值明显不同。高浓度ＡＴＰ对脱镁tＰＮＡ显示抑制作用,说明金属离子是氨酰化反应的底物之一。     

人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸的生物活力测定

本文报道了用一种高灵敏度的方法测定人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的生物活力。tRNA_y~(Ala)在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下接受丙氨酸后,用操作简便而回收率较高的酒精沉淀法回收氨酰化产物,最后,在兔网织红细胞裂解液无细胞蛋白合成体系中,测定氨酰化产物中的丙氨酸转移到蛋白质中去的能力——参入活力。这方法不仅可以测定分离纯化的tRNA_y~(Ala)的活力,而且也可以测定经T_4RNA连接酶连接两个半分子后的反应混合物中产物tRNA_y~(Ala)的活力。利用这方法,已成功地测定了微至5—7 pmoles的人工全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力和参入活力两组数据。测定结果表明,全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力是天然分子的51.6—65.6％,是经拆合的天然分子的91.3—106.0％。其氨酰化产物中的[~3H]-Ala在兔网织红细胞裂解液中的利用率为61.6—63.1％,是天然分子的90.6—91.7％,是经拆合的天然分子的97.2—115.8％。     

气相中环糊精与甘氨酰-苯丙氨酰-苯丙氨酸和甘氨酸三肽非共价复合物的质谱研究

为了探索环糊精和寡肽的非共价相互作用, 一定化学计量比的α-, β-, γ-环糊精(CD)分别和甘氨酸三肽(GGG)、甘氨酰-苯丙氨酰-苯丙氨酸三肽(GFF)在室温下反应达到平衡并用正离子模式质谱检测. 实验结果显示GGG, GFF均可以和α-, β-, γ-CD生成1:1配合比的非共价复合物. 碰撞诱导解离实验进一步验证了α-, β-, γ-CD与GGG, GFF非共价复合物的形成. 质谱滴定法测得的结合常数结果表明环糊精和两种三肽形成非共价复合物的结合强度均按照γ-, β-, γ-CD的次序逐渐增大. GGG和α-, β-, γ-CD复合物的结合常数分别为2799.96, 2528.73, 1697.11 L·mol^-1, GFF和α-, β-, γ-CD复合物的结合常数分别为2773.94, 2134.03, 1330.68 L·mol^-1. 对于α-, β-或γ-CD, 含有苯基的GFF+CD复合物的结合强度要小于相应的脂肪族的GGG+CD复合物, 表明虽然在气相GFF+CD复合物的构象与溶液中的构象有所变化, 但是苯基仍然参与和环糊精疏水腔体的键合作用.     

紫草萘醌类化合物对乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶的共价修 饰作用

为研究紫草萘醌类化合物的细胞毒性作用机制,从新疆软紫草根中分离出四种紫草萘醌类化合物β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁(1),乙酰阿卡宁(2),β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(3)和阿卡宁(4)。研究了四种天然紫草萘醌类化合物对乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶的共价修饰作用。酶活力测定结果表明,这四种紫草萘醌类化合物对两种脱氢酶都具有不同程度的抑制作用;酶分子中游离氨基和巯基修饰率的测定结果表明,紫草萘醌类化合物对两种酶的抑制作用主要是通过与酶分子中的巯基共价结合产生的。     

抗抑郁化合物SIPI5358与环糊精形成的非共价复合物

用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串级质谱(MS/MS),并结合紫外光谱、荧光光谱等方法,研究一种芳烷醇哌嗪类抗抑郁化合物SIPI5358与α-、β-、γ-环糊精(CD)制备得到的非共价复合物.质谱分析结果显示,SIPI5358分子可以和α-CD生成配合比为1∶1的非共价复合物,而与β-、γ-CD生成不同配合比的非共价复合物.串级质谱的结果进一步验证β-CD与SIPI5358非共价复合物的组成.用紫外光谱和荧光光谱实验对液相中非共价复合物的形成进行了辅助研究,结果均再次验证了非共价复合物的生成.荧光光谱实验测得SIPI5358与β-CD反应的生成常数Kf=3.45×103 mol.L-1.     

酵母AHAS酶与磺酰脲类抑制剂作用模型的分子对接研究

基于酵母乙酰羟酸合成酶(AHAS)与磺酰脲类抑制剂复合物的晶体结构, 用分子对接方法对AHAS与5个磺酰脲类抑制剂相互作用的方式进行了系统的分子对接研究. 晶体复合物对接和假复合物对接两种模式对接的结果基本相同, 并与实验结果吻合. 在进一步的对接中逐级考虑了辅酶FAD和TPP的影响, 结果表明, 辅酶FAD和TPP的加入, 对AHAS酶与磺酰脲类抑制剂的结合顺序基本没有影响. 其中FAD的加入使AHAS与抑制剂的结合更加稳定, 这主要是由于抑制剂的R2取代基与FAD中的平面基团Flavin环间存在的范德华相互作用所致; 抑制剂与TPP间存在的静电相互作用可能是加速TPP降解的原因.     

大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶巯基的修饰及标记肽的顺序测定

E. coli LeuRS分别被DTNB,NEM,IAA修饰后,丧失氨基酸活化和氨酰化活性,这两种活性基本上平行地下降,DTNB,NEM和IAA的二级反应常数分别为1700,150和0.46mol/L~(-1)min~(-1),化学计量显示LeuRS的一个巯基是活性必需的,底物Leu和Leu-AMP对该巯基的修饰有明显的保护作用,表明这一活性巯基处于LeuRS的氨基酸活化区域,经过[~(14)C]NEM标记LeuRS巯基,胰蛋白酶完全酶解,HPLC分离标记肽段及顺序测定,表明[~(14)C]NEM主要的标记位点是~(179)Cys~*-Asp-Thr-Lys~(182),这一结果提供了氮基酸活化区域位于LeuRS N瑞区的证据。     

吸水链霉菌井冈变种谷氨酰胺合成酶的研究

本文证明吸水链霉菌井冈变种产生一重要的农用抗生素——井冈霉素,生物合成中抗生素产量与菌体谷氨酰胺合成酶有正相关性,因此我们对这一酶进行了纯化,并研究了它的理化性质和调节特征。此酶分子量为530000,亚基分子量为43000;电子显微镜观察结果证明酶由十二个亚基组成,呈双层正六角形排列,酶活力最适pH为7.2,并需Mg~(2 )或Mn~(2 )作为辅因子。此酶受代谢产物的反馈抑制和积累反馈抑制;同时也受腺苷酰化和去腺苷酰化的共价键调节,即当酶处在腺苷酰化状态,保持低活性,去除腺苷酰基后可恢复其高活性,这一结果为谷氨酰胺合成酶共价键修饰存在于革兰氏阳性细菌提供了有力的例证。     

电喷雾质谱法研究人参皂苷Rb1和Rd与细胞色素c的非共价复合物

用质谱法研究了人参皂苷Rb1和Rd与细胞色素c的非共价相互作用, 证明主-客体之间形成了多种化学计量比的复合物, 用直接计算的方法得出人参皂苷Rb1和Rd与细胞色素c形成的非共价复合物的各级解离常数KD, 用竞争体系验证了计算结果, 二者结果相互吻合.     

基于非天然氨基酸的蛋白质生物正交标记

生物正交化学反应正日益成为在活体内对生物大分子进行特异标记的一种有效方法. 最近涌现出的一个突出的例子是将金属钯催化的碳碳偶联反应这一在有机合成领域具有里程碑意义的反应拓展到生物大分子的标记上. 在活细胞上进行生物正交反应的一个先决条件是需要将参与这类反应的正交官能团特异地引入到目标生物大分子当中. 遗传密码子拓展技术是将多种生物正交活性基团引入到蛋白质当中的一种先进的手段; 最近发展出的基于吡咯赖氨酸氨酰合成酶和tRNA的体系能够将携带有生物正交官能团的非天然氨基酸有效地引入到原核生物、真核生物, 甚至是动物体内的蛋白质上. 在这一展望中, 我们首先介绍在生物正交反应和遗传密码子拓展这两个领域内的研究前沿与进展. 接着我们将讨论将这些新发展的研究工具, 尤其是基于钯催化的生物正交反应和基于吡咯赖氨酸氨酰合成酶的遗传密码子拓展技术, 应用于标记和修饰哺乳动物细胞蛋白质上的优势和诱人前景. 生物相兼容性更好的正交反应和更为灵活的非天然氨基酸引入技术必将有力地增强和拓宽人们在活细胞环境下特异操纵蛋白质的能力.     

钕和镧离子对tRNA圆二色谱的影响

采用圆二色谱方法对钕和镧离子与转移核糖核酸间的相互作用进行了研究,结果显示在1.5～6 μmol/L Nd³⁺或La³⁺离子存在下,tRNA分子CD谱260 nm(+)峰蓝移2～3 nm, 260 nm(+)峰值分别增加6%和20%左右;210 nm(-)峰在不同摩尔比Nd³⁺/tRNA作用下,谱峰蓝移或红移,峰值增加或降低50%左右。结果说明结合在tRNA分子上的Nd³⁺或La³⁺可能引起tRNA分子构象的变化。Eu³⁺对大肠杆菌LeuRS或tRNA^Leu-LeuRS复合物的CD谱具有一定的影响。     

meso-四(4-酰肼基苯基)卟啉及其金属配合物共价和非共价修饰多壁碳纳米管

采用新方法合成了meso-四(4-酰肼基苯基)卟啉及其金属配合物, 通过化学键将酰肼卟啉上的酰肼基与活化的多壁碳纳米管(MWNTs)发生酰胺化反应, 从而得到卟啉共价化学修饰的多壁碳纳米管复合物; 利用卟啉环上的π电子与多壁碳纳米管管壁上的π电子通过π-π堆积效应, 得到卟啉非共价化学修饰的碳纳米管复合物. 通过红外光谱、紫外和荧光光谱对比分析, 发现在卟啉与碳纳米管间存在强烈的电子效应, 且非共价修饰的卟啉-碳纳米管复合物的荧光猝灭率更高.     

抗抑郁化合物SIP15838和环糊精分子非共价复合物的研究

报道了用电喷雾电离质谱(ESI-MS),并结合紫外分光光度法及溶解度实验,研究一种新型的具有自主知识产权的抗抑郁化合物SIPI5838与α-环糊精(CD)和β-环糊精(CD)分子生成的非共价复合物.质谱测量结果表明,在溶液中,SIPI5838分子可以与环糊精分子之间生成非共价复合物,且两者之间的配比关系为1:1.这些非共价复合物的形成可以显著地提高这种抗抑郁化合物在水溶液中的溶解度,使得它作为高效的口服或注射药物成为可能.另外,还用紫外分光光度法和溶解度实验对液相中非共价复合物的形成进行了辅助研究,这些结果均显示了非共价复合物的生成.根据溶解度实验结果,计算了SIPI5838和两种环糊精分子在液相中的生成常数.它们分别为SIPI5838-β-环糊精:1.83×103 mol-1·L,SIPI5838-α-环糊精:3.15×101mol-1·L.两种非共价复合物的稳定程度为β-环糊精-SIPI5838>α-环糊精-SIPI5838.     

一种氟代腺苷类衍生物的合理设计与合成

针对抗结核药物新靶酶——腺苷酰化酶家族的泛酸合成酶,以生物电子等排原理,模拟泛酸合成酶催化的中间体,用氟取代中间体糖环上2’位羟基,合理设计了目标化合物5’-O-{[(R)-2-羟基-3,3-二甲基丁酰基]磺酰胺基}-2’-去氧-2’-氟腺苷(1).以D-叔亮氨酸和阿糖腺苷为原料,通过9步反应合成得到目标产物.其结构经1H NMR,13C NMR和HRMS表征确认.