疏水腔修饰法及高活力GPX抗体酶的研究：Ⅱ.半抗原及全抗原的制备和表征

自Jencks抗体酶的概念出现以来，已有80多种化学反应被证实可以用抗体来催化［‘”j．一般合成抗体酶的方法是通过选择合适的过渡态类似物来诱导抗体酶，这种方法产生的抗体酶大部分活力很低，我们曾对3个具有谷脱甘肽（GSH）过氧化物酶（GPX）特性的含硒抗体酶进行了报道「”‘a，半抗原是，2，3是根据天然抗体酶活性中心的结构设计合成的，它们对GPX的底物GSH具有不同程度的疏水修饰．随着半抗原疏水程度的增加，通过单抗技术和化学修饰而得的3个抗体酶的相应活力分别为兔肝GPX的0．2，1·6和8．5倍．在上述结果基础上，我们提出疏…     

新型含磷抗原的合成

肽键的水解在生命化学中起着重要的作用, 利用人工合成的抗原诱导具备天然肽酶活性的抗体酶具有深远意义, 因而众多的工作集中于催化酰胺键和肽键水解的抗体酶的研究. 这些工作通常是以Paulling的过渡态理论为指导, 以磷为中心原子设计合成类似肽键或酰胺键水解过渡态结构的过渡态类似物. 然而按照这种方法得到的抗体酶很少具有肽酶活性. 金声等[1]曾以CPA的肽底物马脲酰苯丙氨酸为模型, 以四面体过渡态类似物为基础, 用硫代替磷, 设计合成了新型半抗原[2]. 制备了相应的具有活性的抗体酶, 然而这样的结果尚不能说明以硫原子代替磷原子的方法的优越性, 因此有必要以磷原子为中心原子合成出一个类似抗原, 将其诱导出的抗体相互比较, 才能得到有意义的结论. 本文报道了含磷抗原的合成, 合成路线如下:     

抗体酶及其应用

生物学家一项惊人的发现：人体防御体系的武装－抗体，也能象酶那样起作用。这些被称作抗体酶的研究成功将会引起２１世纪生物技术的一场革命。本文介绍抗体酶的结构、制备方法、催化特征、应用及其发展前景。     

甲状腺素脱碘抗体酶制备半抗原和全抗原的合成与单克隆抗体的制备

铜离子;衍生物;甲状腺素脱碘抗体酶制备半抗原和全抗原的合成与单克隆抗体的制备     

可溶性人源含硒抗体酶GPx的研究

对噬菌体展示人单链抗体库进行筛选,得到与半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二丁酯特异结合的单链抗体3B10。用计算机模拟分析了单链抗体的空间结构,发现抗原结合的CDR3区位于抗体的表面,推测其可能进一步参加硒化反。利用突变引物,在大肠杆菌中表达了可溶性抗体蛋白,并用化学方法将催化必需基团硒代半胱氨酸（Sec）组装到3B10抗原结合部位,获得了具有谷胱甘肽过氧化酶活力的人源抗体酶。动力学研究结果表明,抗体酶和天然酶一样,符合乒乓反应机制。     

抗体酶催化化学反应的新进展

本文评述了近几年来抗体酶催化化学反应的研究进展, 包括酯和酰胺的水解反应、脱羧反应、Claisen重排、Diels-Alder反应、不对称诱导作用、β-消去反应、金属络合物作用、氧化-还原反应、光诱导聚合和消除反应等, 讨论了介质效应和反应机理。     

抗体酶的发现者——舒尔茨

舒尔茨最先发现了抗体具有酶活性,可以催化特定的化学反应,进一步研究发现了一系列这样的抗体酶,并且对其催化机理也有了较为全面的理解,此外舒尔茨还应用化学知识来研究一系列有机小分子在生命调节过程中的作用,从而为一些生命现象的理解和新型药物的开发提供了研究手段。     

活力高于天然谷胱甘肽过氧化物酶的含硒抗体酶

还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基和两个羧基分别与2,4-二硝基氯苯(DNCB)和甲醇反应,合成出半抗原Hp2;通过戊二醛将Hp2连到牛血清白蛋白(BSA)上,合成出全抗原Ag2;吸收光谱法测出Hp2在BSA上的平均连接量为30.2mol/mol.用标准的单克隆抗体(McAb)制备技术,制备出阳性McAb(IgG)-4G3;4G3对GSH和半抗原Hp2的解离常数(K_D)表明,单克隆抗体4G3对GSH具有较强的亲和力.对4G3进行两步化学诱变(Chemical Mutation),诱变后即为具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的含硒抗体酶(m4G3),m4G3的GPX活力为9337U/μmol,是兔肝GPX(RL-GPX,5780U/μmol)的 1.6倍,曾报道的含硒抗体酶m4A4(1239 U/μmol)的7.5倍,制备出活性高于天然酶的抗体酶,证实了半抗原设计思想.将m4G3拆分成Fab和Fc片段,发现m4G3的活性中心位于Fab片段上,m4G3的硒代半胱氨酸(Se-Cys)含量为1.9 mol/mol.     

催化性抗体

在酶的模拟方式上,最近出现了一种新的策略,这就是所谓催化性抗体(catalyticantibody)或“抗体酶”(abzyme)。将经过特殊设计并合成的有机分子作为半抗原(haptene),经过细胞杂交技术,培养单克隆抗体,这种抗体具有酶的特性,能催化某些特殊的化学反应。     

水溶液及有机溶剂中固定化催化抗体的行为

水溶液及有机溶剂中固定化催化抗体的行为Ｋｉｍ．Ｄ．Ｊａｎｄａ教授等人宣布，抗体酶的固定化已经取得了初步成功。他们描述了固定化催化抗体在水溶液和有机溶剂中的行为，结果说明在水溶液条件下模拟脂肪酶的催化抗体键合到无机载体上，并保持了他们固定化前在溶液中的...     

具有甲状腺素脱碘酶活性的抗体酶的化学修饰

甲状腺素脱碘酶是一种膜硒蛋白[1], 它能够将甲状腺素降解为不同产物, 并对甲状腺素的生理功能起调控作用. 但是, 甲状腺素脱碘酶极易变性失活, 到目前为止仍未得到纯酶[2]. 近来, 此酶的人工模拟工作逐渐成为热点. 我们小组[3]首次以3,5,3′,5′-四碘甲状腺原氨酸五水钠盐(T4)为半抗原, 采用单克隆抗体技术和苯甲基磺酰氟及硒氢化钠修饰的方法, 成功地制备了具有甲状腺素脱碘酶活性的抗体酶.     

Novel functional activities of anti-dna autoantibodies from sera of patients with lymphoproliferative and autoimmune diseases

DNA-hydrolyzing activity of IgG autoantibodies from sera of patients with various types of lymphoproliferative diseases was investigated. The association of DNA-hydrolyzing activity with the antibody (Ab) fraction has been proved by newly developed affinity-capture assay. Study of abzyme incidence in blood tumors and systemic lupus erythematosis (SLE) revealed linkage of anti-DNA Ab catalysts to mature B-cell tumors, and increased probability of DNA-abzymes formation on the background of autoimmune manifestations. These data suggest possible similarity between mechanisms of abzyme formation in SLE and B-cell lymphomas. A new mechanism of formation of DNA-specific catalytic Abs has been proposed based on the increased crossreactivity of polyclonal DNA-abzymes to DNA-depleted nuclear matrix proteins. The possibility of the abzyme production as Ab to the energetically destabilized ground state of the antigen has been discussed. Preliminary results were obtained that indicate the complement-independent cytotoxicity of anti-DNA autoantibodies isolated from blood of patients with SLE and chronic lymphocytic leukemia.     

Two‐step chromatography purification of IgGs possessing sialidase activity from human blood serum

Sialation of cell surface is known to be tightly connected with tumorigenicity, invasiveness, metastatic potential and clearance of aged cells, while sialation of immunoglobulin G (IgG) molecules determines their anti‐inflammatory properties. Recently, we have found for the first time IgG‐antibodies possessing sialidase‐like activity (sialylic abzyme) in blood serum of multiple myeloma and systemic lupus erythematosis patients. This abzyme was detected in a pool of IgGs purified by a typical procedure including immunoglobulin's precipitation with ammonium sulfate and following chromatography on protein G–Sepharose column. Here we describe a novel matrix for affinity purification of sialylic abzyme that is based on using bovine submandibular gland mucin conjugated to Sepharose matrix (mucin–Sepharose). This matrix preferentially binds sialidase‐like IgGs from a pool of sialidase‐active fraction of proteins precipitated with 50% ammonium sulfate from blood serum of the systemic lupus erythematosis patients. That allowed us to develop a new scheme of double‐step chromatography purification of sialidase‐like IgGs from human blood serum. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.     

Protection of myocardial mitochondria against oxidative damage by selenium-containing abzyme m4G3

Selenium-containing abzyme (m4G3) was prepared and its protection of myocardial mitochondria against oxidative damage was studied using the swelling of mitochondria, quantity of lipid peroxidation products, and change in cytochrome-c oxidase activity as a measure of mitochondrial damage. The results showed that m4G3 could inhibit mitochondrial damage caused by the hypoxanthine-xanthine oxidase system in vitro. Electronic spin resonance (ESR) studies demonstrated that m4G3 could decrease the amount of free radicals generated in the damage system.     

通过快速定点突变表征人源含硒单链抗体酶的底物结合部位

为了对人源含硒单链抗体酶Se-scFv-B3的底物结合部位和催化基团进行研究, 在理论预测的基础上, 通过快速定点突变法分别在2个理论预测的底物结合部位(位点1和位点2)内选定Ala180和Ala44定点突变为丝氨酸(Ser). 2个突变体蛋白经化学修饰将Ser转变成谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的催化基团硒代半胱氨酸(Sec)后, 前者的GPX活力达到了Se-scFv-B3的2倍多, 而后者的GPX活力没有明显提高, 这表明位点1可能是主要的底物结合部位, 与理论预测的结果一致.     

Catalytic mechanism of an abzyme displaying a beta-lactamase-like activity

A catalytic IgG (Ab2) displaying a beta-lactamase-like activity was previously obtained by using the antiidiotypic pathway: the particularity of this antibody is that it is a true antiidiotype of the beta-lactamase active site. We have previously demonstrated that this IgG has retained some of the structural information displayed by the beta-lactamase active site, evident from data that polyclonal anti-Ab2 antibodies (Ab3) recognize beta-lactamase. In this article, we investigated the catalytic mechanism of the abzyme compared to that of the enzyme. The experimental data allow us to hypothesize the catalytic residues required for catalysis.     

Synthesis and Characterization of Specific Haptens Used to Generate Abzyme with Glutathione Peroxidase Activity *

ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｈｅｇｒｅａｔｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎａｂｚｙｍｅｈａｓｂｅｅｎｍａｄｅｄｕｒｉｎｇｔｈｅｌａｓｔｄｅｃａｄｅ［１］．Ｔｈｅｋｅｙｔｏｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆａｂｚｙｍｅｉｓｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｈａｐｔｅｎ．Ｏｎｔｈｅ...     

具有甲状腺素脱碘酶活性的抗体酶的制备及性质研究

首次以具有适当疏水性的甲状腺素衍生物O-methyl-T4为半抗原,用杂交瘤技术得到相应的抗体(6E8),又经过苯甲基磺酰氟和NaHSe的化学修饰引入了催化基团硒代半胱氨酸,制备出具有较高甲状腺素脱碘酶活力的抗体酶(Se-6E8).用SDS-PAGE电泳对Se-6E8的纯度进行了鉴定,同时研究了其解离常数、温度及pH等酶学性质.结果表明,Se-6E8活力为2010U/μmolprotein,纯度达到电泳纯,催化反应的最适温度为57℃,最适pH为82.     

具有GPX活力的抗体片段Fv的制备和性质

具有谷胱甘肽(GSH)结合部位的鼠抗体3H₄(IgM)经胃蛋白酶水解,产生分子量为25000的抗体Fv片段,用荧光滴定法测定了它与GSH的亲和常数K_a=1.17×10₇L/mol.该片段经苯甲基磺酰氟活化,再经NaHSe作用,其结合部位的丝氨酸被突变为谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的催化基团硒代半胱氨酸.突变后的Fv片段表现出很高的GPX活性,其活力高达2500U/μmol,称为Fv抗体酶.动力学分析表明,Fv酶的最适温度为55℃,最适pH为7.0,催化机制为乒乓机制,米氏常数分别为:K_m(GSH)=4.16×10^-3mol/L,K_m(H₂O₂)=2.8×10^-4mol/L.     

含铁离子的XO/HX体系对糖类分子氧化作用的ESR研究

用自旋俘获方法直接检测含铁的黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤体系中由糖产生的自由基,发现该体系中除了产生羟基自由基外,还产生烷(氧)基自由基,且糖的浓度越高,体系中产生的烷(氧)基自由基也越多.这表明含铁的黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤体系对糖类分子有氧化作用,且糖的浓度越高,氧化作用越强,对机体的损伤越大.应用含硒抗体酶可有效清除烷(氧)基自由基,显示出很强的抗氧化能力.