马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

一株新黄瓜花叶病毒卫星RNA结构和生物学分析

从患香蕉花叶心腐病香蕉病叶分离的黄瓜花叶病毒中,发现一株新卫星RNA(定名为Ba-Sat)。以CMV卫星RNA两端保守序列为引物合成了Ba-Sat cDNA并将其克隆到载体pGEM7Zf(+)上。序列分析结果表明,Ba-Sat由390个核苷酸组成,其5′端、3′端各有一段序列与其它株系卫星RNA有很高的序列同源性,但其中间区域则无任何序列同源性。在此基础上,进一步分析了Ba-Sat的二级结构,并研究了Ba-Sat的生物学特征,实验结果证明Ba-Sat具有致弱卫星RNA的特性。     

MDMV外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

报道了玉米矮花叶病毒(MDMV)全长外壳蛋白cDNA基因的克隆、序列分析和表达产物鉴定的结果。根据其cDNA序列推测的外壳蛋白氨基酸顺序全长共有313个氨基酸,分子量总和为35 400 D,与聚丙烯酰胺凝胶电泳估算的值36 000 D相近,克隆的病毒外壳蛋白基因cDNA 3′-末端非编码区含有256个碱基。将此外壳蛋白的基因插入pUC19的1acZ基因中,转入E.coli后诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异性的蛋白带,经Western吸印与抗MDMV的兔血清呈阳性反应,证实所克隆的cDNA基因为MDMV外壳蛋白基因,并且能够正确表达。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及其植物表达载体的构建

从感病的萝卜叶片中得到芜菁花叶病毒(TuMV)的分离物,以oligo(dT)为引物,合成了其基因组RNA的互补DNA,并克隆到载体λ-ZAPⅡ中。通过单链cDNA探针杂交和DNA末端序列分析找出含有poly-A尾巴的阳性克隆。我们对一个含有1429个碱基插入片断的克隆进行了序列分析,根据芜菁花叶病毒外壳蛋白分子量的大小和马铃薯Y病毒组蛋白质加工位点氨基酸序列的保守性,确定了外壳蛋白基因的5′末端。利用PCR方法对其5′末端进行改造,加进起始密码ATG和两个限制性内切酶位点。通过基因重组操作,将该基因插入到双元载体pBI121的衍生物pBIN437中,得到芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体。     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

家蚕和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒P10基因的研究

从AcMNPV基因组DNA中克隆筛选得到含P10基因的EcoR I-P片段,以此作为探针克隆得到BmNPV P10基因片段,测定了其全核苷酸序列。PCR点突变BmNPV P10基因启始密码子ATG区,ATG突变的同时形成一个Bgl Ⅱ酶切位点,突变后的启动子及其5′端作为5′端交换臂和AcMNPV的P10基因3′端作为3′端交换臂构建成一个非融合通用转移载体pBmAcPV1.该载体可以在Sf细胞中和野生型AcMNPV DNA共转染重组表达外源基因,也可以在Bm细胞中和野生型BmNPV DNA重组表达外源基因。CAT基因在BmNPV P10 ATG突变后的启动子的控制下在家蚕细胞中得到高效表达     

启东鸭肝癌中人HBV突变体(pDKHBV)的DNA序列

本文首次报道对启东鸭肝癌中存在的人HBV样DNA~([3])(pDKHBV)的全序列分析。本工作建立了pDKHBV的M_(13)重组克隆及亚克隆,并应用末端终止法测定了它的全序列。结果表明,它长3218bp,与鸭乙型肝炎病毒无关,而同人乙型肝炎病毒(HBV)基因组有91％以上同源性(其中与adw_2亚型有99.0％同源性),存在与HBV一致的4个开放阅读框架,并在Pre-S_1基因下游59个核苷酸,以及C基因3′端分别有1个和2个核苷酸的缺失,造成Pre-S_1基因第58个密码子、C基因第158个密码子出现终止信号,以及P基因第21个密码子起发生移码突变。以上结果表明启东鸭肝癌中存在adw_2亚型HBV的非复制型突变体。由于启东鸭肝癌高发且与人肝癌高发有相关性,提示HBV作为人和鸭肝癌共同病因的可能性。     

淇河鲫生长激素(growth hormone)全长cDNA的克隆与序列分析

用RT-PCR法和3′、5′RACE(Rapid amplification of cDNAends)法从淇河鲫脑垂体RNA克隆出生长激素(Growth hormone,GH)cDNA.此cDNA全长1191 nt(含Poly(A)14 nt),其5′端非编码区长55 nt、阅读框(Open readingframe,OAF)长633 nt,3′端非编码区长503 nt.其推导的GH由210个氨基酸组成,其中氮端前22个氨基酸为信号肽部分.氨基酸序列比较表明:淇河鲫与同目的鲫鱼、鲤鱼、团头鲂和斑马鱼的同源性分别为98.6%,96.2%,91.5%和88.6%;与不同目鱼的胡子鲇和鳗鲡的同源性分别为74.6%和49.5%;与哺乳类的家鼠和人等的同源性低于40%.     

中国海南省恶性疟原虫P190抗原变异的研究

本文应用双脱氧末端终止法测定了我国海南省恶性疟原虫FCC1/NH株P190抗原基因的部分DNA序列,共计2103个碱基对。与该基因现有资料比较,我们发现了该虫株P190基因的以下特征:(1)在核苷酸第2323至2340位间有18bp长的片段缺失,此缺失正位于该抗原一个重要T细胞表位和T-E-X三肽重复序列处。(2)该基因属MAD20变异型,但从3′端5013位起转变为K1型序列,表明在该处发生了基因内重组。(3)在N端三肽重复区为高度变异区,但该基因却与MAD20型序列呈现高度同源性。(4)除了缺失和5个碱基点突变外,其余序列符合双态性变异规则。本工作为P190疟疾疫苗的发展提供了可靠依据。     

大鼠小肠壁细胞葡萄糖转运蛋白一级结构及功能的研究

应用序列同源性cDNA作探针,从大鼠小肠壁细胞cDNA文库中筛选出了葡萄糖转运蛋白cDNA克隆。经双脱氧法测定该克隆的cDNA全序列为2466bp,翻译区1566bp,编码522个氨基酸。从氨基酸全序列分析得到12个疏水区段,每区段为21个氨基酸。此葡萄糖转运蛋白可能在细胞膜上跨膜12次,构成葡萄糖通道。     

鲤鱼线粒体URFA6L基因和tRNA~(Lys)基因的结构分析

鲤鱼线粒体URFA6L基因全长165个核苷酸,其结构同爪蟾URFA6L基因非常相似,它们的核苷酸序列间有68％的同源性.鲤鱼URFA6L蛋白共有54个氨基酸,它的组成成分极不寻常,几乎半数是属于5种疏水氨基酸(脯氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸).比较了5种脊椎动物URFA6L蛋白和酵母ATP酶亚基8的氨基酸序列,发现它们有一些相同的结构特点,推测脊椎动物URFA6L蛋白起着ATP酶亚基8的作用.我们还测定了鲤鱼线粒体赖氨酸tRNA基因的核苷酸序列,并绘制了三叶草形的二级结构.鲤鱼线粒体rRNA~(Lys)基因同两栖类和哺乳类的tRNA~(Lys)基因一样,有许多不同于细胞质tRNA~(Lys)基因的不寻常结构特点.比较了7种脊椎动物tRNA~(Lys)基因的核苷酸序列,发现最保守的部分是反密码环、第8和第9个核苷酸、可变区、反密码茎和氨基酸接受臂.最不保守的区域是D-环和T-环.这些结构特点可能反映了线粒体tRNA~(Lys)同线粒体核糖体有不寻常的作用方式.     

拟南芥psrp-3基因的PCR扩增与生物信息学分析

采用PCR法获得拟南芥叶绿体核糖体psrp-3基因序列并进行生物信息学分析.根据psrp-3基因序列保守区设计2对引物,通过RT-PCR获得预期大小的基因序列,琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段.利用生物信息学软件对拟南芥psrp-3基因序列进行同源比对、氨基酸组成、功能域、二级结构、疏水性、蛋白质功能及系统进化分析和预测.结果表明,RT-PCR获得了一段753 bp的序列,psrp-3蛋白是等电点为9.27的亲水性稳定蛋白,包含一个结构域和一个区域,α螺旋和不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件,β折叠和伸展链散布其中,和菠菜、葡萄、蓖麻、大豆等的psrp-3蛋白有较高的同源性.为进一步了解psrp-3基因的功能和作用机制打下基础.     

高效抗虫转基因烟草的研究

苏云金杆菌HD-1的杀虫蛋白基因经5′端改造,3′端进行4种不同长度缺失后插入到含有双增强子的35S启动子,翻译增强子“Ω′”片段的双元载体中,借助土壤农杆菌LBA 4404将在此双元载体上的杀虫蛋白基因及新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)转入到生产品种烟草NC89的染色体上,从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用1—3龄烟青虫对这些转化植株进行大量重复虫试结果表明用4种不同长度B.t.基因转化的再生植株中都有抗虫性高的植株,其中以1.8kb的B.t.Cry IA(c)基因转化的植株杀虫效果最好,这一组转基因植株的平均杀虫率在90—100％的约占该组总虫试植株的50％。对高抗虫性植株的子一代(T1)和子二代(T2)进行遗传分析,分子生物学分析和进一步的抗虫试验表明B.t.基因已遗传到子代并初步选到了高抗虫性的转基因纯合株系D8-14和D19-8等。     

不同的引导肽对丝状噬菌体基因8蛋白展示外源多肽的影响

为了研究不同的引导肽对在基因8蛋白上展示外源多肽的影响,利用基因工程方法将一短肽插入基因8蛋白的N端,并将引导多肽去除或用基因3蛋白的引导肽序列替代基因8的引导肽序列.采用放射性脉冲追踪技术检测不同的引导肽对在基因8蛋白上展示外源多肽的作用.结果表明,无引导肽序列的引导,蛋白前体无法向成熟蛋白转化.基因3蛋白的引导肽可以引导展示有外源多肽的基因8蛋白,完成从前体向成熟蛋白的转化,但转化率明显下降.研究结果对阐明噬菌体外壳蛋白在大肠杆菌中的跨膜机制具有重要的意义.     

人参叶全长cDNA文库的构建及部分克隆的序列分析

提取人参叶组织总RNA,用SMART[TM]cDNA文库构建试剂盒所示方法,以λTriplEx2为载体构建了人参叶cDNA文库.经测定该文库初始滴度为1.2×106pfu/mL,扩增后滴度为7.6×1010pfu/mL,重组率为86%.插入片段长度为0.3~2.5 kb.随机挑取16个cDNA克隆体进行测序分析,结果显示16个克隆体中有8个同GenBank中登录的人参皂苷合成相关基因GBR5,GBR3和GBR1高度同源,8个为新的基因序列.人参cDNA文库的建立为克隆人参中有明确功能的特异基因以及克隆和研究人参中的新基因奠定了必要的物质基础.     

水稻种子贮存蛋白Prolamin 4a基因的组织特异性表达调控

本文分离了水稻中花8号种子贮存蛋白Prolamin基因的5′端调控区域,对其DNA的全序列结构作了分析,表现启动子DNA的典型序列结构。构建了GUS融合基因,利用农杆菌LBA4404双元载体系统转化烟草,分子杂交获得转基因烟草植株,在转基因烟草开花20天时,对烟草种子作GUS基因表达的组织化学分析。实验结果表明Prolamin基因的启动子在种子的胚乳中激活下游GUS基因的表达,这是水稻Prolamin基因5′端调控序列功能的首次报道。     

野生大豆(Glycine soja SH1)球蛋白glycinin Gy4基因家族的两种表达拷贝

本文研究我国野生大豆(Glycine soja)种子贮藏蛋白基因的结构,并与栽培大豆进行比较,构建成野生大豆Glycine soja SH1和栽培大豆Glycine max子叶cDNA库。用已知含球蛋白glycinin Gy 4基因的克隆DNA λS 312为探针,从两个cDNA库中分离出6个克隆。其中两个克隆pWS 228与pWS 242含全长cDNA,克隆cDNA的限制酶图谱和cDNA与基因组DNA的Southern法杂交表明它们代表野生大豆球蛋白glycinin Gy 4基因家族的两种表达拷贝。pWS 228 cDNA的部分序列已测定并与栽培大豆相应顺序作比较。分子杂交还证明Ⅱ类glycinin基因家族的组编在野生大豆胚形成过程中的变动。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3'-端十九核苷酸(58-76)的合成

研究了两个低聚核糖核苷酸的3′-端磷酸化方法.以3′-端带磷酸单酯的低聚核苷酸为供体,用T_4 RNA连接酶将AUUC,CGGA,CUCGUCCA和CCAp等按低的供受体摩尔配比(1∶1.1至1∶2),以87～90％的连接率合成了相应于酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端53～76核苷酸顺序的十九核苷酸AUUCCGGACUCGUCCACCAp.     

兔早期胚泡特异肽的cDNA克隆

从家兔受精后第6天(着床前)的早期胚泡构建cDNA文库,经阶段特异分子杂交筛选,克隆了仅在此时期表达的9种胚泡特异肽类的cDNA对其中一种丰度较高的cDNA克隆进行了研究,测出其编码区含有285碱基对,5'和3'侧翼区各有132和170碱基对.经DNA序列分析,推导出一种分泌性多肽的一级结构,由75个氨基酸组成.计算机分析显示它与迄今报道的所有基因和蛋白在结构上无任何同源性.     

中国人HCV基因组NS3区c33-c抗原基因cDNA克隆和在大肠杆菌中表达

本文通过逆转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR)从一份来自山东省泰安市的丙型肝炎病毒(HCV)RNA打点杂交阳性的中国人血清中扩增并克隆到一段约850bp的HCV基因组NS3区c33-c抗原基因,测定该基因的全序列后发现,中国人HCV泰安分离株与HCV Ⅰ型株HCV-US和Ⅱ型株HCV-BK在该基因区段的核苷酸/氨基酸序列同源性分别为79.2％/91.3％和91.3％/93.9％。利用原核高效表达载体pBV220在大肠杆菌中有效地表达了非融合的c33-c重组蛋白,通过免疫筛选法及Western印迹法对约占菌体可溶性蛋白14％的表达产物进行了鉴定。采用Triton X-100和尿素处理表达产物后再进行离子交换层析,纯化得到可用于检测HCV血清抗体的c33-c抗原。利用该抗原与HCV核壳蛋白区的分支状合成肽一起组装成中国第二代免疫酶法(E1A)测定HCV抗体试剂盒,其检测特异性、灵敏度和精密性完全符合HCV诊断试剂的国家质控标准,已基本达到国际上第二代HCV E1A主流试剂的水平。