海藻酸钙凝胶包埋乳酸氧化酶催化DL-乳酸生产丙酮酸

研究了用海藻酸钠包埋、戊二醛交联法固定耻垢分枝杆菌(Mycobacterium Srnegmatis)生成乳酸氧化酶的最佳条件,比较了原酶与固定化酶的酶学性质.将1mL酶液和1 mL质量分数为3%的海藻酸钠溶液的混合液,用注射器滴加到20 mL0.2 mol/L.的CaCl2溶液中,25℃静置固化2 h后,过滤洗涤,将同体转移至20 mL质量分数为0.2%戊二醛溶液中37℃交联2 h后,过滤、洗涤和干燥得到球状同定化酶.固定化酶的活力回收率为39.8%.酶学性质研究表明,此固定化酶的热稳定性较好,游离酶在65 ℃保温l h酶蛋白完全变性失活,而固定化酶在65℃保温1 h仍可保持86%的酶活力;其最适酶促反应温度可由37℃升至55℃,最适反应pH=7.4保持不变;在不加保护剂的条件下,4℃放置50 d后游离酶仅保持40%以上的酶活力,而固定化酶能保持80%以上的酶活力.该固定化乳酸氧化酶用于催化氧化DL-乳酸生产丙酮酸,3 h后丙酮酸产率可达75%,连续循环使用5次固定化酶活力仍保持85%.     

磁性纳米氮化铝颗粒固定化β-葡萄糖苷酶的性质

以戊二醛为交联剂,研究了磁性纳米氮化铝颗粒固定化β-葡萄糖苷酶的条件及固定化酶的结构特征,并考察了固定化酶的某些酶学性质.结果表明,在4.5 ml磁性纳米氮化铝颗粒悬液(100 mg/ml)中加入0.5 ml戊二醛溶液(2%)超声波分散后,加入5 ml β-葡萄糖苷酶溶液(50 mg/ml),于20℃,pH 5.0和100 r/min条件下固载3.5 h,酶蛋白和酶活回收率分别为82.6%和78.4%.固定化β-葡萄糖苷酶的结构松散,不改变酶的结构特征.与游离酶相比,固定化酶对对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷水解反应的最佳反应温度有所降低,最佳反应pH值有所升高,而米氏常数Km值有所增大,且具有良好的贮存稳定性和操作稳定性,表明磁性纳米氮化铝颗粒适合作为β-葡萄糖苷酶的固定化载体.     

乙酰鸟氨酸脱乙酰酶固定化细胞拆分D,L-缬氨酸

报道了一种利用具有乙酰鸟氨酸脱乙酰酶活性的固定化细胞拆分D,L-缬氨酸的新方法. 该酶促反应最适条件: pH=6, 反应温度50 ℃, 底物N-乙酰-D,L-缬氨酸浓度200 mmol/L, 固定化细胞用量0.2 g/mL(或100 U/mL). 0.1 mmol/L CoCl₂条件对该酶促反应有显著的激活作用. 在以上条件下反应2～3 h, 测得产物L-缬氨酸浓度95 mmol/L. 该固定化细胞连续10次使用, 平均转化率为90.8%(以N-乙酰-L-缬氨酸计), 显示出了良好的工业化应用前景.     

4-[3-(4-溴苯基)-3-氧代-1-芳基丙氨基]-N-(嘧啶-2-基)苯磺酰胺的合成及其α-葡萄糖苷酶抑制活性初步研究

为了寻求新颖的抗糖尿病药物, 我们将芳香醛、对溴苯乙酮和磺胺嘧啶通过一步反应直接合成了16个未见报道的含有磺胺嘧啶结构的β-氨基酮化合物, 制备方法简便、反应条件温和, 收率为10.0%～80.1%. 所制备的化合物通过1H NMR, 13C NMR, MS和HRMS进行结构表征与确证. 对这些化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性初步检测, 结果表明部分化合物在低浓度范围(8.1～9.3 nmol•mL－1)具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性.     

壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性质

以具柔性亲水手臂的壳聚糖-精氨酸树脂为载体,用戊二醛交联胰凝乳蛋白酶,获得壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶. 最佳固定化条件为:m(酶)∶ m(载体)=20∶ 1 000、戊二醛体积分数为1.0%、pH=5.20、30 ℃交联60 min. 固定化酶活力达850 U/g,Km为1.83 mmol/L,比游离酶增大33.6%,比交联壳聚糖固定化酶低24.0%. 壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶水解时间进程曲线与游离酶基本一致,均在反应30 min达到最大速率,最适温度为70 ℃,比游离酶升高10 ℃;在75 ℃时的半衰期可达6.0 h,比游离酶提高约4.3倍;最适pH值为5.92,比游离酶向酸性偏移2pH单位. 4 ℃贮存半衰期为49 d.     

哈茨木霉CGMCC 2979生物转化栀子中的京尼平苷制备京尼平

采用微生物直接转化药材的方法,将栀子中的京尼平苷转化为京尼平,无需糖苷酶和京尼平苷的制备. 在培养温度为30 ℃,pH 6.1以及栀子载量为80 g/L的条件下,48 h京尼平苷的转化率为97.8%. 转化后的京尼平通过XAD-16N大孔树脂偶联硅胶层析的方法,制备得到纯度大于95%的京尼平,收率为62.3%. 在催化、转化机制研究中,从哈茨木霉CGMCC2979的发酵液中分离得到了分子量为74.4 kDa的京尼平苷β-葡萄糖苷酶,该酶最优催化条件为50 ℃和pH 4.0-5.0. K_m和V_max分别为3.6 mmol/L和775 μmol/h/mg蛋白. 本文提供了一种简便、高效制备京尼平的新方法.     

固定化扩展青霉脂肪酶的制备及其在玉米油转酯反应中的应用

采用吸附法对来源于扩展青霉Penicillium expansum的脂肪酶进行了固定化.从20种不同来源的树脂中筛选出固定化效率高且价格低廉的D4020树脂作为载体,系统研究了固定化条件对固定化效率及固定化酶转酯活力的影响.结果表明,最适加酶量、缓冲液pH和吸附时间分别为0.7 g/g、9.4和4 h.冻干时添加0.5%的半乳糖有助于提高固定化酶的转酯活力.在上述优化条件下,固定化酶的转酯活力为404.0 U/g,而所用的游离酶不能催化该转酯反应.利用该固定化酶催化玉米油转酯反应生产生物柴油时,叔戊醇为适宜的反应介质,其最适添加量为0.5 ml/g;适宜的酶量、加水量和反应温度分别为60.6 U/g、油重的1.2%和35℃.按醇/油摩尔比为1的比例分别在反应0、2和6 h时加入甲醇,在优化反应条件下,反应24 h后甲酯产率达85.0%;固定化脂肪酶具有较好的操作稳定性,反应10批次时,相对酶活力为62.8%.     

壳聚糖固定化乳酸脱氢酶的制备及酶学性质研究

以磁性壳聚糖作为载体,戊二醛作为交联剂,对乳酸脱氢酶(LDH)进行固定化.固定化的最适条件为:戊二醛浓度6%,pH值7.5,酶的偶联时间2 h.对游离及固定化LDH酶学性质的研究表明,酶促反应的最适pH值为9.2,最适温度分别为37℃和50℃,对乳酸的表观米氏常数分别为1.6 mmol/L和0.9 mmol/L.游离酶和固定化酶在40℃放置150 min后,其活力分别为最初的56.5%和76.1%.固定化酶在4℃贮存4周后,活力仍保留50%以上.固定化酶在室温下与底物重复反应6次后,活力仍保留60%以上,说明固定化酶具有较好的热稳定性、贮存稳定性和复用性.     

不对称还原制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的双酶共表达重组菌的构建

克隆了来自于枯草芽孢杆菌的羰基还原酶基因IolS和葡萄糖脱氢酶基因GDH,采用Ni-NTA镍亲和层析柱对重组蛋白IolS进行纯化,并对纯酶进行了酶学性质研究.结果表明,该羰基还原酶的最适温度和pH值分别为30oC和6.0;在40oC以下具有较好的热稳定性;在pH5.57.0的偏酸性范围内能保持75%以上的酶活.采用三种策略构建了IolS和GDH的共表达重组质粒,结果发现,采用双启动子的重组质粒能够实现羰基还原酶IolS的高效表达,粗酶液中的IolS和GDH的比酶活均达到1.5U/mg.运用该重组菌对10g/L的OPBE进行不对称还原,反应15h后,底物转化率大于99%,产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的ee值达到99.5%.     

木瓜蛋白酶交联聚体的制备及性质

采用交联酶聚体(CLEAs)技术制得了木瓜蛋白酶CLEAs, 优化了制备条件. 以纯乙醇为蛋白沉淀剂, 质量分数40%戊二醛为交联剂, 于4 ℃下对酶沉淀聚体交联16 h; 所得木瓜蛋白酶CLEAs的最适pH为6.0(游离酶最适pH=7.0), 最适温度范围由游离酶的80 ℃拓宽为50～80 ℃, 热稳定性和溶液稳定性亦明显提高; 微观形貌分析证明木瓜蛋白酶CLEAs优良的催化效能及稳定性来自于CLEAs单元所具有的高比表面积及单元内部多点共价固定的结合方式.     

基于氨基柱的高效液相色谱-示差折光检测器方法分析媚丽葡萄香气糖苷的糖基组成

建立了基于氨基柱的高效液相色谱分析媚丽葡萄香气糖苷的糖基组成的方法.媚丽葡萄果皮经提取缓冲液(0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4,pH 7.0,13%(V/V)乙醇)浸提,葡萄香气糖苷提取物在柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)中用AR2000糖苷酶水解,释放出糖基,经氨基柱分离,用高效液相色谱-示差折光检测器(HPLC-RID)分析.色谱分析条件为:柱温35℃,RID温度35℃,进样量20 μL,流动相为乙腈-乙酸乙酯-水(60∶25∶15,V/V),流速1.0 mL/min.结果表明,鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、芹菜糖和葡萄糖在线性范围内线性关系良好(R2>0.996),检出限为93~123 mg/L,定量限309~409 mg/L, 5 g/L各单糖的峰面积的精密度(n=10)为2.3%~6.4%;糖基样品的各单糖加标回收率在73.8%~125.7%之间.以糖基类别划分的媚丽葡萄各类香气糖苷的摩尔百分比为: 6-O-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷,4.1%~6.1%;6-O-β-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷,2.3%~8.8%;6-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷,0.1%~3.9%;6-O-α-L-呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷,5.5%~9.8%;6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷,76.3%~86.8%.媚丽葡萄成熟过程中,各类香气糖苷的含量及其总量与浆果成熟度之间没有明显的相关性.     

壳聚糖的酶法降解

用壳聚糖酶降解壳聚糖,探讨了壳聚糖降解过程中温度、pH值、底物浓度和金属离子对酶促反应的影响。结果表明:酶促反应进行到5 h左右时,即可得到聚合度小于10的壳寡糖。该酶促反应的最适温度为50℃,最适pH=5.5;最适底物浓度为0.02 g/mL;金属离子Ca2+和Mg2+对酶降解有一定的促进作用,而Zn2+、Cu2+对酶降解有较强的抑制作用。该酶促反应符合米氏动力学方程,米氏常数Km=7.80 g/L,最大反应速率Vmax=7.72 g/(min.L)。     

有机溶剂/缓冲液两相体系中全细胞催化拆分环氧氯丙烷

研究了有机溶剂/缓冲液两相体系中重组大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)全细胞水解动力学拆分外消旋环氧氯丙烷制备(R)-环氧氯丙烷的过程.结果表明,最适反应条件为:最适有机溶剂异辛烷与缓冲液的体积比7:3,最适缓冲液pH 8.0,底物浓度574mmol/L,全细胞加入量0.07g湿菌体/ml溶液,温度30℃.在此条件下于1L反应器中反应45min,(R)-环氧氯丙烷的摩尔产率、光学纯度和时空产率分别达到37.5%,99.3%ee和0.286mol/(L·h).与单一水相体系相比,异辛烷/缓冲液两相体系中底物浓度和(R)-环氧氯丙烷时空产率分别提高了55.2%和98.6%.     

酶法拆分(±)-N-(2,6-二甲苯基)-丙氨酸甲酯

用脂肪酶Candida rugosa lipase (CRL)拆分(±)-N-(2,6-二甲苯基)-丙氨酸甲酯, 并进一步优化反应条件. 结果表明, 在加入1 mmol N-(2,6-二甲苯基)-丙氨酸甲酯、100 mL的0.2 mol/L磷酸缓冲液中, CRL拆分该底物的最适反应条件为: pH 6.4, CRL脂酶250 mg, 聚乙二醇(PEG) 2 g, 转速160 r•min^－1, 温度 35 ℃. 其中酶量、温度对转化率影响较大. 反应后分离得R-(＋)-N-(2,6-二甲苯基)-丙氨酸甲酯. 它和酰氯反应可制备一系列旋光性N-酰基丙氨酸类杀菌剂.     

聚碳酸乙烯撑酯与双端氨基聚乙二醇交联体系固定化酶载体的合成与表征

将聚碳酸乙烯撑酯(PVCA)与α,ω-双端氨基聚乙二醇(H₂N-PEG-NH₂)溶于DMF,于液蜡中进行交联反应制得亲水性固定化酶载体,将其与胰蛋白酶进行偶联反应制备了固定化胰蛋白酶.酶蛋白的比活力及其于载体上的结合量与反应条件有关,当w(PVCA)/w(H₂N-PEG-NH₂)为0.5时,二者均处于最高值.此固定化酶酶促反应的最适pH值和Km值均较之溶液酶有显著提高,但二者的最适酶促反应温度却相当一致.     

来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因的合成与融合表达

将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换, 利用化学和基于聚合酶链反应(PCR)技术的酶促方法进行基因全合成, 利用pET-32a构建重组表达载体pET-dan, 转化进E.coil BL21(DE3)中进行融合表达. 经SDS-PAGE电泳、 Western-blot检测和活性测定发现, D-ANase可在大肠杆菌中高效表达, 目的蛋白可达到菌体总蛋白的69.2%, 密码子优化后基因构建的工程菌发酵活性为96 U/mL, 重组蛋白经超声细胞破碎及Ni²⁺柱亲和层析纯化, 比活可达1692.3 U/mg, 纯度可达95%以上.     

重组β-木糖苷酶转化人参皂苷Rb3及C-Mx

从Aspergillus niger NG1306菌株中扩增得到β-木糖苷酶基因anxyl, 与pPICZαA连接构建了表达载体pPICZαA-anxyl, 进一步在毕赤酵母KM71H中诱导表达获得了目的酶蛋白重组β-木糖苷酶(Anxyl); 并将其用于人参皂苷Rb₃及C-Mx的生物转化及催化动力学参数表征. 研究结果表明, Anxyl可将人参皂苷Rb₃和C-Mx分别转化为人参皂苷Rd和C-K. 酶学性质研究表明, 该酶最适反应pH=2.5, 最适反应温度为35 ℃; 在pH=2.0~5.0, 20和30 ℃条件下其具有较好的稳定性, Mg²⁺对酶活具有促进作用. Anxyl对葡萄糖和乙醇有较好的耐受性, 其催化对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)、 人参皂苷Rb₃和C-Mx水解的米氏常数(K_m)值分别为3.1, 1.55和1.04 mmol/L, 酶的最大反应速率(V_max)分别为1.9×10², 0.8×10³和8×10³ mmol/min, 酶的转换数(K_cat)值分别为5.55, 0.17和1.85 s^-1, 表明该酶对天然底物Rb₃和C-Mx具有更高的亲和力.     

黑曲霉脂肪酶的耦合固定化及特性

研究了吸附-絮凝耦合的方法固定脂肪酶的工艺条件.结果表明:在33℃下,用0.03mol/L的磷酸二氢钾?氢氧化钠缓冲液控制体系pH为7.0,酶与树脂(质量比1∶8)作用吸附1h后,用0.2mL絮凝剂聚丙烯酰胺(w(PAM)=0.5%)处理,得到活力较高的固定化脂肪酶.固定化酶最适pH9.0,最适温度为45℃,活力为405U/g,酶活回收率可以达到40%.固定化脂肪酶制备简便,可重复使用,稳定性较高.     

聚酰胺-胺树状大分子修饰硅胶固定化胰蛋白酶的研究

以聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子修饰的硅胶为载体,胰蛋白酶为模型,考察了PAMAM的代数和固定化条件对酶的固载量及活力的影响.实验结果表明:选用3.0代PAMAM树状大分子修饰硅胶为载体固定化胰蛋白酶,酶促反应最适pH值为9.0,最适温度为60℃,对酪蛋白表现米氏常数K<,m>为7.76mg/mL,固定化胰蛋白酶表...     

嗜热古细菌Sulfolobus tokodaii脱卤酶在D-乳酸生产中的应用

将来源于嗜热古菌Sulfolobus tokodaii的脱卤酶(L-HADST)基因克隆到载体p ET28b,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在蛋白的N末端带有6个组氨酸融合标签,纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示融合蛋白的分子量约为25000.融合蛋白催化2-氯丙酸(2-CPA)的最适反应温度为70℃,最适p H值为9.5.以外消旋2-CPA为底物生产D-乳酸,利用HPLC检测反应液中2-CPA及乳酸的变化,发现L-HADST只催化L-2-CPA脱氯反应.对酶催化反应条件进行了优化,结果表明,在p H值为9.5,温度为60℃的条件下,当反应体系中缓冲液浓度为3 mol/L,底物浓度为0.5 mol/L,酶浓度为3×104U/L时有较高的底物转化率及乳酸生成量.依据条件优化结果可知,影响反应速度的因素有底物浓度、缓冲液浓度以及酶浓度,其中底物浓度变化对转换率的影响最明显.