基于纳米金探针和基因芯片的DNA检测新方法

运用荧光纳米金探针和基因芯片杂交建立一种新的DNA检测方法. 荧光纳米金探针表面标记有两种DNA探针: 一种为带有Cy5荧光分子的信号探针BP1, 起信号放大作用; 另一种为与靶DNA一部分互补的检测探针P532, 两种探针比例为5∶1. 当靶DNA存在时, 芯片上捕捉探针(与靶DNA的另一部分互补)通过碱基互补配对结合靶DNA, 将靶DNA固定于芯片上; 荧光纳米金探针通过检测探针与靶DNA及芯片结合, 在芯片上形成“三明治”复合结构, 最后通过检测信号探针上荧光分子的信号强度来确定靶DNA的量. 新方法检测灵敏度高, 可以检测浓度为1 pmol/L的靶DNA, 操作简单, 检测时间短. 通过改进纳米金探针的标记和优化杂交条件, 可进一步提高核酸检测的灵敏度, 这将在核酸检测方面具有重要的应用价值.     

纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA的检测

利用两组探针修饰的微粒:(1)表面标记有可与待测乙肝病毒(HBV) DNA另一端结合的纳米金探针1(信号探针)以及可与信号探针部分结合的纳米金探针2(检测探针);(2)表面标记有可与待测HBV DNA一端结合的磁珠探针(捕捉探针1).检测靶HBV DNA时,磁珠探针与信号探针在液相中可分别与HBV DNA靶序列一端结合最终形成三明治样结构.再以磁场将三明治样复合物从反应液中分离,以DTT溶液将信号探针从纳米金颗粒上洗脱.洗脱后的信号探针数量反映靶基因的多寡,信号探针一段与预先点样的基因芯片上的捕捉探针2结合,检测探针与信号探针另一段相结合,最后用银染液将检测探针显色从而得到靶目标DNA相对定量信息.结果表明,本检测方法的检测灵敏度达到10-15 mol/L水平.检测时间少于1.5 h,检测结果与HBV DNA水平呈现较好的线性关系且无假阳性结果;本方法有望用于乙肝病人血清中HBV DNA的快速筛测及其它微生物基因的检测.     

DNA修饰电极的研究(Ⅸ)--DNA探针在金基底上的固定、表征及其表面分子杂交

采用疏基化合的自组装／共价键合反应的逐层固定方法将双链DNA固定到金表面得到DNA修饰电极,并对该电极表面进行了电化学和X射线光电子能谱表征。研究了电极表面固定化DNA的表面分子杂交。对开发电化学基因诊断芯片和基因传感器具有一定意义。     

基于纳米金胶标记DNA探针的电化学DNA传感器研究

以纳米金胶为标记物,将其标记于人工合成的5-端巯基修饰的寡聚核苷酸片段上,制成了具有电化学活性的金胶标记DNA电化学探针;在一定条件下,使其与固定在玻碳电极表面的靶序列进行杂交反应,利用ssDNA与其互补链杂交的高度序列选择性和极强的分子识别能力,以及纳米金胶的电化学活性,实现对特定序列DNA片段的电化学检测以及对DNA碱基突变的识别.     

DNA功能化纳米金用于生物小分子检测

纳米金是金的微小颗粒,在水溶液中以胶体金的形态存在。胶体金的颜色会随着其粒径及表面修饰差异而发生变化,这种颜色变化可通过肉眼观察;同时,这种改变会产生强烈的光散射或光吸收信号。基于这种信号而建立的纳米金比色检测法,已被广泛用于生物分子(如核酸、蛋白质、多糖甚至是细胞)的检测。DNA功能化纳米生物传感器是利用核酸碱基配对原则进行识别,能实现特定基因片段的持续、快速、灵敏和选择性检测。本文结合最近十年的研究现状,主要论述了DNA功能化纳米金用于比色检测法的原理及用于核酸、蛋白质和部分生物小分子的检测,并评述了其中的挑战和前景。     

DNA功能化纳米金用于生物小分子检测

纳米金是金的微小颗粒,在水溶液中以胶体金的形态存在。胶体金的颜色会随着其粒径及表面修饰差异而发生变化,这种颜色变化可通过肉眼观察;同时,这种改变会产生强烈的光散射或光吸收信号。基于这种信号而建立的纳米金比色检测法,已被广泛用于生物分子(如核酸、蛋白质、多糖甚至是细胞)的检测。DNA功能化纳米生物传感器是利用核酸碱基配对原则进行识别,能实现特定基因片段的持续、快速、灵敏和选择性检测。本文结合最近十年的研究现状,主要论述了DNA功能化纳米金用于比色检测法的原理及用于核酸、蛋白质和部分生物小分子的检测,并评述了其中的挑战和前景。     

基于DNA四面体纳米结构探针的电化学生物传感器检测DNA甲基化

该文以DNA四面体纳米结构探针(TSP)为捕获探针,将辣根过氧化物酶标记的IgG抗体结合在纳米金颗粒表面(AuNPs-IgG-HRP)作为信号分子,构建了一种新型DNA甲基化电化学传感器。利用一步热变性法组装成TSP后,通过Au—S键固定在修饰纳米金颗粒的金电极表面,经过靶标DNA杂交、5-甲基胞嘧啶(5-mc)抗体及AuNPs-IgG-HRP结合后,用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测。采用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)对修饰电极的构建过程进行电化学表征。探究了杂交时间、5-mc抗体浓度、IgG-HRP加入体积、氢醌(HQ)和过氧化氢(H₂O₂)浓度对传感器的影响。在最佳条件下,该传感器对甲基化DNA的线性响应范围为1.0×10^-15～1.0×10^-10 mol/L,检出限(S/N=3)为4.4×10^-16 mol/L。该传感器具有良好的选择性和稳定性,为DNA甲基化检测提供了新方法。     

含寡聚腺嘌呤序列DNA探针在金纳米粒子上的固定及杂交性能

利用寡聚腺嘌呤序列(OAS)与金的强相互作用,在金纳米粒子(AuNPs)上固定不同密度DNA探针(DNAprobe),详细探究不同条件(OAS长度、AuNPs粒径、NaCl浓度等)下单链DNAprobe的固定效果,以及制备的纳米探针(Au-probe)与互补DNA目标分子(DNAtarget)的杂交性能.利用透射电子显微镜(TEM)、紫外可见分光光度计(UV-Vis)、激光粒度仪等对制备的AuNPs的形貌、粒径、表面DNAprobe固定及杂交性能等进行了研究.结果表明,随OAS碱基数量由10增加到30和50,Au-probe上固定的DNAprobe数量降低.对粒径为10.2和24.3 nm的AuNPs,杂交效果最佳的NaCl浓度分别为300和25 mmol/L.随着AuNPs粒径增大,AuNPs单位面积上的DNAprobe固定量及DNAtarget杂交量均呈下降趋势.     

基于金纳米粒子的QCM实时检测DNA错配的研究

利用石英晶体微天平（QCM）技术,用双硫醇分子作为连接剂,将金纳米粒子固定于金电极表面,以人类p53基因片断为DNA探针,研究了其在QCM金电极表面的固定、杂交和错配,重点探讨了金纳米粒子修饰的DNA错配碱基个数和错配位点对杂交的影响。在实验条件下,金纳米粒子在QCM金电极表面的修饰使其灵敏度得到了明显提高;而且,错配碱基个数和错配碱基位点的差异都对杂交产生了不同程度的影响。     

高灵敏纳米金比色芯片检测乙型肝炎病毒DNA及其变异

构建了新型纳米金比色芯片,利用Taq DNA连接酶的连接特异性,将其与乙型肝炎病毒DNA( HBV-DNA)靶序列完全互补杂交的捕获探针(固定在芯片上)和纳米金修饰的探针连接成一条链,从而将纳米金颗粒固定到芯片点阵上,再通过银染反应放大,形成裸眼可见的显色信息.通过点阵的位置及灰度,即可判断HBV-DNA靶序列的单碱基突变,并得出相对定量信息.本实验对不同浓度的HBV-DNA靶序列进行了检测.结果显示:此技术对单碱基突变有很强的特异性识别能力,并且具有较高的灵敏度(约10 pmol/L),在10～100 pmol/L浓度范围内表现出较好的线性关系.该技术检测时间短(＜1 h)、操作简单、不需要特殊的检测设备,具有很好的临床应用前景.     

Detection of Hepatitis B Virus DNA by Duplex Scorpion Primer-based PCR Assay

The application of a new fluorogenic probe-based PCR assay (PCR duplex scorpion primer assay) to the detection of Hepatitis B virus (HBV) DNA in human sera was described. Duplex scorpion primer is a modified variant of duplex Amplifluor, and the incorporation of a PCR stopper between probe and primer sequences improve the detection specificity and sensitivity. Combined with PCR amplification, this probe can give unambiguous positive results for the reactions initiated with more than 20 HBV molecules. In addition, the particular unimolecular probing mechanism of this probe makes the use of short target-specific probe sequence possible, which will render this probe applicable in some specific systems.     

分子信标用于不对称PCR检测乙型肝炎病毒

为了缓解竞争杂交对分子信标检测的影响，将分子信标与不对称聚合酶链式反应(PCR)联用进行血清中乙型肝炎病毒(HBV)的检测。并采用更为直接的荧光方法，将不对称PCR扩增中的引物浓度比确定为5：1，该结果与电泳方法得到的结果有所不同。文中结合对称及不对称PCR过程中荧光强度的变化情况，对其原因进行了详细的探讨。分子信标与不对称PCR联用，可以专一地检测出血清中HBV的存在，与分子信标／对称PCR相比．其检测效果明显增强。     

Application of Single—labelled Probe—primer in PCR Amplification to the Detection of Hepatitis B Virus DNA

A new method based on the incorporation of a single-lablled probe-primer into polymerase chain reaction(PCR) for the detection of PCR-amplified DNA in a closed system is reported.The probeprimerc consists of a specific probe sequence on the 5‘‘‘‘‘‘‘‘-end and a primer sequence on the 3‘‘‘‘‘‘‘‘-end.A flurophore is located at the 5‘‘‘‘‘‘‘‘end.The primeR-quencher is an oligonucleotide,which is complementary to the probe sequence of probe-primer and labelled with a quencher at the 3‘‘‘‘‘‘‘‘-end.In the duplex formed by probe-primer and primer-quencher.the fluorophore and quencher are kept in close proximity to each other.Therefore the fluorescence is quenched.During PCR amplificatio,the specific probe sequence of probeprimer binds to its complement within the same strand of DNA,and is cleaved by Taq DNA polymerase,resulting in the restoration of fluorescence.This system has the same energy transfer mechanism as molecular beacons,and a good quenching effciency can be ensured.Following optimization of PCR conditions,this method was used to detect hepatitis b virus(HBV) dna in patient sera.This technology eliminates the risk of carry-over contamination,simplifies the amplification assay and opens up new possibilities for the real-time detection of the amplified DNA.     

Electrochemical Monitoring of DNA Hybridization by Multiwalled Carbon Nanotube Based Screen Printed Electrodes

The application of multiwalled carbon nanotube (MWCNT) based screen printed graphite electrodes (SPEs) was explored in this study for the electrochemical monitoring of DNA hybridization related to specific sequences on Hepatitis B virus (HBV) DNA. After the microscopic characterization of bare MWCNT‐SPEs and DNA immobilized ones was performed, the optimization of assay has been studied. The development of screen printing process combined with nanomaterial based disposable sensor technology leads herein a great opportunity for DNA detection using differential pulse voltammetry (DPV) by measuring the guanine oxidation signal observed at +1.00 V in the presence of DNA hybridization between HBV probe and its complementary, target. The detection limit estimated for signal to noise ratios =3 corresponds to 96.33 nM target concentration in the 40 μL samples. The advantages of carbon nanotube based screen printed electrode used for electrochemical monitoring of DNA hybridization are discussed with sensitivity, selectivity and reproducibility in comparison with previous nanomaterial based electrochemical transducers developed for DNA or other biomolecular recognitions.     

血清样品中乙肝病毒的DNA电化学传感器检测

利用自组装单分子膜技术，将巯己基修饰的具有乙肝病毒(HBV)DNA序列特异性的单链DNA探针固定在金电极表面，制得DNA电化学传感器；以电活性的Hoechst 33258为指示剂，考察了该传感器对血清样品中乙肝病毒DNA的响应；探讨DNA电化学传感器在临床检测中的应用；将传感器法与荧光聚合酶链反应(PCR)法进行对比，两者的分析结果具有一致性。     

Investigation of Metal Ion Effect on Specific DNA Sequences and DNA Hybridization

In this article, we investigated the sequence specific interaction of single (ssDNA) and double stranded (dsDNA) with silver ions (Ag⁺) with electrochemical methods. We, for the first time, examined the effect of base sequences, base content and physiochemical properties of different DNA sequences on interaction with Ag⁺ in detail. We used different base contents to show how the composition of nucleic acid influences the electrochemical signals. We first immobilized ssDNA probes on bare graphite electrodes. Then, we showed the sequence effect on oxidation signals of AgDNA complex by sensing Ag⁺ to the probe coated surfaces to interact with different ssDNA sequences. Furthermore, we investigated the effect of Ag⁺ on dsDNA. We measured the oxidation signals obtained from Ag⁺‐ssDNA and Ag⁺‐dsDNA complex at approximately 0.2 V and 1.0 V (vs Ag/AgCl), respectively with Differential Pulse Voltammetry (DPV). We showed that the oxidation signals of the AgDNA complex obtained from dsDNA‐modified electrodes is higher than the electrodes modified with ssDNA. More importantly, we showed that Ag⁺‐ssDNA and Ag⁺ ion‐dsDNA exhibit different electrochemical behaviors.     

DNA在纳米金标上的组装、杂交、检测与银增强

利用电化学方法进行DNA的杂交检测.将目标ss-DNA固定在玻碳电极表面, 使其与纳米金标记的互补DNA发生杂化反应, 通过银增强试剂（该种试剂可以使银在纳米金表面沉积, 达到信号增强的效果）在纳米金上沉积银, 形成银包金的核壳结构.在酸性介质中沉积的银被氧化释放, 以离子状态存在于溶液中.用阳极溶出伏安法(ASV)检测银离子从而达到间接检测目标DNA的目的.测定结果表明，ss-DNA的浓度在100～1 000 pmol•L－1 范围内有非常好的线性关系, 检测限为10 pmol•L－1.