[B10Glu,B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法,将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu,在B24和B25位之间插入Asp,构建了[B10Glu,B24-Asp-B25]胰岛素原基因.利用通用型质粒pBV220构建表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白为包含体形式,约占菌体总蛋白的20%～30%.经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白.用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物.用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质,用圆二色谱测定了构象变化.放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明,突变体分子缔合性明显下降,放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73.6%和146%.     

[B10G1u,B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法, 将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu, 在B24和B25位之间插入Asp, 构建了\胰岛素原基因. 利用通用型质粒pBV220构建表达载体, 在大肠杆菌DH5α中表达, 表达蛋白为包含体形式, 约占菌体总蛋白的20%～30%. 经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白. 用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切, 经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物. 用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质, 用圆二色谱测定了构象变化. 放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明, 突变体分子缔合性明显下降, 放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73.6%和146%.     

[Bl0Glu，B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法，将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu，在B24和B25位之间插入Asp．构建了[B10Glu，B24-Asp-B25]胰岛素原基因、利用通用型质粒pBV220构建表达载体，在大肠杆菌DH5a中表达．表达蛋白为包含体形式．约占菌体总蛋白的20％～30％．经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白、用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切．经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物．用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质．用圆二色谱测定了构象变化、放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明，突变体分子缔合性明显下降．放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73．6％和146％。     

化学合成的亮氨酸脑啡肽基因在大肠杆菌中的克隆和表达

化学合成的亮氨酸脑啡肽(LEK)基因与质粒pBR322重组,转化大肠杆菌,经过原位杂交筛选,限制性图谱分析和Southern杂交鉴定,获得一批LEK基因重组体。插入乳糖操纵子(1ac)启动基因控制LEK基因的表达。一个lac转录方向和LEK基因转录方向相同的表达质粒,pLE103,能在大肠杆菌中产生LEK。用放射免疫分析方法检测,LEK的产量可达每毫克细菌蛋白426毫微克。     

Ⅴ.结晶胰岛素的全合成

牛胰岛素的全合成工作是在天然胰岛素的两条链重组合成功,并获得重合成的结晶胰岛素;以及人工合成的A及B链分别与天然胰岛素的B及A链组合成功,并分别获得半合成结晶胰岛素的基础上进行的。我们自1964年第一次获得具有生物活力的全合成产物以来,在工作中不断实践,不断总     

遗传工程研究获得重大突破——化学合成基因使大肠杆菌生产脑激素

去年十一月二日,美国Riggs和Boyer等七人研究小组报告用化学方法合成的生长激素释放制抑因子(Somatostatin,以下缩写为som)的基因,已通过遗传工程技术重组,转移到大肠杆菌中,并且从这细菌的发酵液成功地获得了期望的脑激素——som,第一次用合成的基因创造了能生产脑激素的大肠杆菌。美国科学院院长Handler欢呼这是“科学上头等的大胜利”。在此以前,虽已有大量基因转移到大肠杆菌中,但是却没有一个能生产预先设计的蛋白质或多肽,例如去年夏天加州大学重组DNA的胰岛素小组报导:大鼠胰岛素基因转移进大肠杆菌已获得成功,但用此细菌生产胰岛素却没有成功。     

以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

我国人乳头瘤病毒6型新变种基因组克隆及L1晚期结构基因在大肠杆菌中表达

本文从一例中国妇女外阴尖锐湿疣组织标本中提取DNA,BamHI酶切,以pAT153为载体,成功地克隆了我国人乳头瘤病毒6型(HPV-6BV)基因组.经South-ern杂交,酶谱及部分DNA序列分析,发现该克隆的HPV6基因组有明显变异,可视为我国发现的第一个HPV6的新变种.本文进一步分离了HPV6BV的L1基因,以pUR288为载体,在大肠杆菌中表达了β-半乳糖苷酶/HPV6BVL1N融合蛋白.经免疫转印试验证明,它既能与β-半乳糖苷酶抗血清反应,又能与HPV抗体反应,具有融合前各自的抗体亲和活性.该蛋白可用作诊断试剂及流行病学研究.     

一个链霉菌的质粒pHZ65及其载体的发展

FR-001和FR-005为农抗5102产生菌经原生质体融合后所产生的融合重组子,它们在形态及培养特征,抗菌活性及代谢产物方面均有明显差别。然而,它们则均含有一个DNA顺序同源,分子量大小均为20.1kb的质粒,命名为pHZ65。已用酶切分析法制做了这个质粒被限制内切酶BamHI,BclⅠ,BglⅡ,EcoRV,KpnⅠ,PstⅠ,SphⅠ,SstⅠ,XhoⅠ酶切共29个切点的详细图谱。在体外将携带了硫链丝菌素抗性基因tsr(可在链霉菌中表达)和氨苄青霉素抗性基因amp(可在大肠杆菌中表达)的大肠杆菌质粒pIJ2703插入到pHZ65的BclⅠ或BglⅠ位点,获得了4个既可转化链霉菌,又可转化大肠杆菌的双功能质粒pHZ200,pHZ201,pHZ206和pHZ207。将pHZ65的片段克隆到pIJ2703的BclⅠ位点所组建的一系列质粒在链霉菌中的复制能力揭示出pHZ65的必要复制功能区位于5个BglⅡ片段的2个连锁的片段(分别为4.44和0.52kb)之内。已从pHZ65衍生了一系列链霉菌——大肠杆菌的双功能载体。这类载体可以转化吸水链霉菌应城变种(FR-001和FR-005的融合亲本),而许多其它质粒载体则不能。     

蛋白质顺序测定技术(一)

引言自从1955年F.Sanger测定了胰岛素结构以后,促进了蛋白质一级结构测定技术的发展。目前世界上搞清一级结构的蛋白质已有一千多个,其中最大的为β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase),它由1021个氨基酸组成。氨基酸自动分析仪,自动顺序仪和高效液相层析技术的出现,更使蛋白质一级结构测定技术突飞猛进。目前仅须几个毫克的样品就能进行一级结构的测定。在我国,蛋白质一级结构的研究比较落后,但目前已有很多单位开展蛋白质一级结构的研究。为了更快促进我们这方面工作的进展,1980年10月西德马-普学会分子遗传研究所的B.Wittmann-Liebold     

化学合成基因的新成就

生长激素释放抑制激素(Somatostatin)是哺乳类动物中才存在的,由下丘脑分泌的多肽类激素,是十四肽。根据遗传密码理论,从上述十四肽的化学结构可以推断出该激素的基因(即脱氧核糖核酸DNA)的化学结构。Itakura等人根据这样推测出来的结构,用化学方法合成了相应的DNA,然后将此DNA连结到控制半乳糖苷酶的生物合成的DNA上。这样得到的DNA再连接到大肠杆菌的质粒上。质粒是一种双链环状     

胰岛素A和B链相互作用的圆二色性研究

本文报道以圆二色性方法在相同条件下测得S-硫甲基型A链的α螺旋、β折迭的含量为15％及27％;B链为22％,23％;A和B链混合后为24％,26％。表明A和B链相混后肽链构象有一定调整,α螺旋含量有所增加。以还原型A及B链进行实验,也得到类似结果。加入二巯基苏糖醇明显减少A及B链的有序成分。上述结果表明胰岛素A及B链有一定二级结构;在能重组成胰岛素的最适条件下,A及B链相混后,因次级键相互作用,两肽链构象有一定调整,有序程度有所提高。     

具有原核基因启动子活性的家蚕核多角体病毒的DNA片段

本文利用大肠杆菌启动子克隆用质粒pHE5,克隆和分离了家蚕核多角体病毒基因组的8种HindⅢ酶解DNA片段和一种SalⅠ酶解DNA片段。我们发现它们都具有指导抗四环素基因表达的启动子活性。测定了含有这些DNA片段的重组质粒的菌株抗四环素能力。其中最高的可以抗四环素至每毫升约30μg。我们分析了一个DNA片段的部分核苷酸顺序。发现它具有与原核基因启动子极相似的顺序结构。     

对有机化学命名法的位次编排上“最小数字原则”的商讨

在有机化合物的命名中,为了表示分子中的官能团、双键、叁键和用词头表示的原子或基的位次,要对碳链以及含有杂原子的碳链进行位次编排(即编号),在编号时一定要遵守“最小数字原则”。但在某些有机化学教材和书里还沿用了1930年“国际化学协会有机化学命名法”第六十四条的规定,即“最小数字包括最低的个别数字和全体数字两种含意”。我认为这是不     

原子转移自由基聚合(ATRP)阳离子化菊粉作为非病毒基因载体的研究

利用原子转移自由基聚合(ATRP)将聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯[P(DMAEMA)]偶联到菊粉多糖(Inulin)上,合成了新型基因载体PDIN.利用核磁共振仪、动态光散射分析仪、透射电子显微镜和凝胶电泳对PDIN及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝胶阻滞实验结果表明,PDIN可以通过静电相互作用稳定结合pDNA.噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、溶血实验、绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及β半乳糖苷酶表达质粒(pβgal)转染实验结果表明,PDIN对MCF-7,Hela,COS7和HepG2细胞的毒性较小;其溶血率低,具有良好的血液相容性;载体PDIN能有效将pGFP和pβgal带入COS7细胞并表达,在N/P为1时转染效率最高,其β半乳糖苷酶的酶活为(3.36±0.74)U/mg蛋白,比Lipo2000转染效率[(4.33±0.77)U/mg蛋白]略低.因此,所合成的载体PDIN是一种有潜在应用价值的非病毒基因载体.     

枯草杆菌信号肽酶Ⅰ的识别序列特异性和信号肽在蛋白质分泌中的作用

本文采用重组体DNA技术使质粒pUB110的β-蛋白质的N-末端编码区与B.licheniformis的α-淀粉酶结构基因融合并产生了信号肽酶Ⅰ识别切割区,从而构建了带有β-信号肽的β AMY基因。该基因借助β-蛋白的可译读码和β-信号肽表达并分泌到胞外,分泌效率约为野生型的10％,通过对不同pβAMY质粒分泌能力的比较、限制性内切酶切点分析和β-信号肽介导下的胞外α-淀粉酶分子量的比较,in vivo证明了B.subtilis信号肽酶Ⅰ的特异识别切割序列为Ala—Ala—Ala Ala,结果还表明B.licheniformis α-淀粉酶在B.subtilis中的分泌作用符合翻译后加工模式。     

牛胰岛素A链的合成及其与天然B链组合成结晶胰岛素

本文报导了牛胰岛素A链的S-磺酸盐(Ⅰ)的合成以及自Ⅰ和天然B链S-磺酸盐(Ⅱ)组合为结晶牛胰岛素的半合成。十二肽酸Ⅴ脱N-保护基后,与九肽酰肼Ⅳ经迭氮化物法缩合得带保护基的A链(Ⅵ),粗产物经钠-液氨处理去保护基后,用乙酸缓冲液调至pH 3.8以除去部分杂质,然后进行S-磺酸化。经纸层析纯化的S-磺酸盐Ⅰ,其旋光率、纸电泳和纸层析的行为、氨基酸组成以及末端分析数据均与天然牛胰岛素A链S-磺酸盐的相符。产物Ⅰ与天然胰岛素B链S-磺酸盐经巯基乙酸还原和空气氧化后,得到的粗产物的生物活力相当于天然牛胰岛素活力的5—10％,经仲丁醇-乙酸柚提后,活力可提高5—10倍,抽提物再经含乙酸锌的丙酮-柠檬酸缓冲液纯化,可得结晶产物Ⅲ,其晶形与天然牛胰岛素相同,其活力(20—23国际单位/毫克)与后者相仿。上述结果及其他证据都证明我们已合成了牛胰岛素A链和所获得的半合成结晶产物就是结晶牛胰岛素。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成

本文报道采用有机合成与酶促合成相结合的方法,按照R.Holley等测定又经他人修正的一级结构,人工全合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的工作。我们合成的tRNA_y~(Ala)与天然的tRNA_y~(Ala)具有相同的化学组成(含有全部修饰核苷酸)和结构,并有完整的生物活力,即在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下,能接受丙氨酸,而且在兔网织红细胞裂解液体系中能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质中去。在进行全合成以前,曾分别进行了两种人工半合成,即将天然的5′半分子与人工的3′半分子和人工的5′半分子与天然的3′半分子进行连接,都取得有生物活力的整分子tRNA_y~(Ala)。据我们了解,这是世界上第一次用人工方法合成的具有生物功能的核糖核酸。     

α-环糊精的研制

本研究用软化芽孢杆菌经发酵培养得到转葡糖基酶。此酶作用淀粉得到由6—7个葡萄糖单元以α-1,4-苷键连结的大环状分子,分别命名为α-环糊精、β-环糊精(简称α-CD,β-CD)。此大环状分子有高亲水性,但分子内空洞是疏水的,因此能作为宿主在空洞内容易以分子间力结合与空洞大小     

苏云金芽胞杆菌含不同质粒和不同基因工程菌的生长代谢

用微量热法研究了世界上产量最大的微生物杀中心剂苏云芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)野生菌株YBT－1463,无晶体突变株BMB160和无质粒、无晶体突变株BMB171以及含量不同杀虫蛋白基因工程菌BMB－304－171－A和BMB－304－171－B的生长代谢动力学变化。结果是,含有14个质粒的野生菌株YBT－1463的生长代谢热比无晶体含6个质粒的变株BMB160和无晶体、无质粒突变株BMB171低;将杀虫晶体蛋白基因vryⅠAc和cryⅠC分别转入受体菌BMB171中后,两个工程菌BMB－303－171－A和BMB－304－171－B生长代谢热与受体菌BMB171相比也吸显降低;表明质粒形成一个耗能过程,当受体菌BMB171转入杀虫晶体蛋白基因后,工菌比受茶杯菌的放热大幅度减少,表明基因编码杀虫晶体蛋白也是一个耗能过程,但是含基因cryⅠAc和cryⅠC工程菌BMB－304－171－A和BMB－304－171－B之间的生长代谢没有明显差异。首次报道这些热动力学变化,对杀虫剂发酵生产过程的代谢控有重要指导意义。