肽段反相色谱保留时间预测算法及其在蛋白质鉴定中的应用

液相色谱-质谱(LC-MS)联用是当今规模化蛋白质鉴定的主流技术。肽段在反相液相色谱(RPLC)中的保留时间主要是由肽段的理化性质和LC条件(固定相、流动相)决定的。可以通过分析肽段的理化性质,并量化它们对肽段色谱行为的影响来预测保留时间。预测结果可以用于帮助提高蛋白质鉴定的数量和可信度,也可用于肽段的翻译后修饰等研究。现在已有的保留时间预测算法主要有保留系数法和机器学习法两大类,得到的预测保留时间与实际保留时间相关系数可达到0.93。随着色谱和质谱技术的不断发展,肽段色谱行为的稳定性和重现性越来越好,保留时间预测结果也越来越准确。预测肽段保留时间将成为提高蛋白质鉴定结果的重要技术手段之一。     

色谱保留时间在蛋白质组研究中的应用

液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)技术是蛋白质组学研究中的常见方法。保留时间作为独立于质谱信息的参数已经被用于蛋白质的鉴定和定量工作中。在多肽鉴定领域,多肽的色谱保留时间预测与常规的二级串联质谱数据库搜索算法结合可以提高鉴定的可信度。鉴定的灵敏度也可以通过匹配多次LC-MS实验中具有相同精确质量数和保留时间的峰而提高。另一方面,由于色谱条件的微小改变即会引起保留时间的变化,因此对多次实验结果进行保留时间比对是进行非标记定量的不可或缺的步骤。另外,联合保留时间偏移和质量数信息还可以进行蛋白质翻译后修饰(post-translational modification, PTM)的鉴定。     

基于特征肽段的液相色谱-质谱技术鉴定胶原蛋白的物种来源

建立了一种基于特征肽段的液相色谱-质谱技术鉴定胶原蛋白物种来源的方法。样品经蛋白提取,还原,烷基化,胰蛋白酶消化后,采用Eksigent C18色谱柱(75μm×150 mm,3μm)分离,用流动相0. 1%甲酸水-乙腈溶液(98∶2)和0. 1%甲酸乙腈-水溶液(98∶2)梯度洗脱,在正离子模式下,通过纳升电喷雾四极杆飞行时间质谱进行检测,数据经Protein PilotTM软件及blast分析,筛选出潜在的特征肽段。消化后的样品再采用Eclipse Plus C18色谱柱(2. 1 mm×100 mm,1. 8μm)分离,用流动相乙腈和1%甲酸水溶液梯度洗脱,在正离子模式下,通过电喷雾四极杆/线性离子阱串联质谱的多反应监测触发增强子离子扫描模式进行检测,进一步确认肽段的特异性。最终筛选并确证了3种猪源性胶原蛋白特征肽段,4种牛源性胶原蛋白特征肽段,1种羊源性胶原蛋白特征肽段。所筛选的特征肽段具有良好的耐热性,可为动物源性胶原蛋白鉴定提供一种特异性强、准确可靠的检测方法。     

基于保留时间和质荷比匹配的液相色谱-质谱联用技术用于非标记肽段的差异分析

建立了一种无需化学标记的,基于纳升级毛细管液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术和质谱数据处理的肽段差异分析方法。本方法采用定量差异分析与肽序列鉴定分析分别进行的策略,首先对样品进行质谱全扫描的液质全谱式分析,在全扫描质谱数据中提取肽特征点信息,通过保留时间和质荷比参数匹配不同样品中的共有肽特征点,比较其相对峰强度有无差异。最后对样品中存在丰度差异的肽特征点进行选择性二级质谱分析和序列鉴定,从而实现复杂样品中肽段的差异比较分析。以血浆蛋白酶解混合物为实验对象,考察了本方法用于肽段相对定量分析的重现性以及浓度信号响应曲线等。结果表明:提取的肽特征点峰强度相对标准偏差的中值<22%,肽段离子强度动态范围达3个数量级,在5～1000fmol范围内对肽段定量具有良好线性关系。本方法可用于不同条件样品中具有倍数差异的内源性肽的比较分析。     

毛细管反相液相色谱-串联质谱用于肽的鉴定和相对定量分析

建立了一种基于毛细管反相液相色谱-串联质谱联用技术和质谱峰强度数据处理的肽段鉴定和相对定量分析方法。该方法无需对样品中的肽进行化学标记,在对样品进行反相色谱分离和串联质谱分析后,将二级质谱扫描数据进行蛋白质数据库搜索,获得所鉴定肽段的序列、保留时间、质荷比、带电荷数等定性信息;再以此为定位依据,在全扫描质谱数据中提取该肽段对应的离子峰并以该离子峰的峰强度作为定量信息,从而实现对不同样品中的共有肽段进行差异比较分析。以标准蛋白酶解混合肽段为实验对象,以肽段相对强度的相对标准偏差为指标,考察了该方法用于肽段相对定量分析的重现性、检测动态范围以及浓度标准曲线等,为将该方法用于生物样品中内源性肽的差异分析奠定了基础。     

依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法的建立及其初步应用

建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较。结果表明,引入色谱保留时间后的智能化选择反应监测质谱方法能够显著提高肽段及蛋白质的鉴定量,并且在复杂体系（如腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物）中效果尤为明显,鉴定到的肽段及蛋白质的覆盖率可分别达到目标肽段和蛋白质数量的89.62%和92.41%,并且灵敏度高、重复性好,能够实现对质荷比相同但保留时间有差异的肽段的准确鉴定。该方法将在复杂生物样本目标蛋白质组高通量、高灵敏度的鉴定、验证和确认中发挥独特作用。     

基于深度学习的保留时间预测方法的研究进展及应用

在基于液相色谱-质谱联用的蛋白质组学研究中,肽段的保留时间作为有效区分不同肽段的特征参数,可以根据肽段自身的序列等信息对其进行预测.使用预测得到的保留时间辅助质谱数据鉴定肽段序列可以提高鉴定的准确性,因此对保留时间预测的工作一直受到领域内的广泛关注.传统的保留时间预测方法通常是根据氨基酸序列计算肽段的理化性质,进而计算...     

蛋白质组衍生肽段文库用于鉴定酪蛋白激酶2的底物模体

模体是蛋白质二级结构上的一种特征序列,激酶底物通常具有一类特征性的模体,识别底物模体对鉴定激酶底物具有重要意义。为了快速鉴定激酶底物模体,将全细胞蛋白质酶解液作为肽段文库的来源,采用碱性磷酸酶去除肽段的固有磷酸化后构建了用于筛选激酶底物模体的肽段文库。该肽段文库是大量非磷酸化肽段的混合物,将此混合肽段与酪蛋白激酶2和三磷酸腺苷作用30 min后,通过固定化金属离子亲和色谱法富集磷酸化肽段,采用反相液相色谱-串联质谱分析,成功地鉴定到472条非冗余底物肽段,包含451个非冗余磷酸化位点,并由此得到底物模体S/T-D/E-x-D/E。该法能够快速准确地筛选出激酶底物模体,对研究激酶-底物识别以及信号转导过程具有重要意义。     

基于启发式方法和支持向量机方法预测有机物的热导率

构建147个有机物分子结构与其热导率值之间的定量结构-性质关系(QSPR)模型, 探讨影响有机物热导率的结构因素. 以147个化合物作为样本集, 随机选择118个作为训练集, 29个作为测试集. 应用CODESSA软件计算了组成、拓扑、几何、静电和量子化学等描述符, 通过启发式方法(HM)筛选得到5个结构参数并建立线性回归模型; 用所选5个结构参数作为支持向量机(SVM)的输入, 建立非线性的支持向量机回归模型. 预测结果表明: 支持向量机回归模型的性能(复相关系数R²=0.9240)虽略低于启发式回归模型的性能(R²=0.9267), 但是支持向量机方法预测性能(R²=0.9682)高于启发式方法的预测性能(R²=0.9574), 对于QSPR模型来说, 预测性能更重要. 因此, 总体来说支持向量机方法优于启发式方法. 支持向量机方法和启发式方法的提出为工程上提供了一种根据分子结构预测有机物热导率的新方法.     

串联飞行时间质谱中亚胺离子的断裂特征及其在肽段鉴定中的作用

基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)产生的亚胺离子可以提供丰富的肽段组成信息,该方法通常用于基于数据库搜索的蛋白质鉴定,或者结合化学衍生法用于从头测序,因而在一定程度上限制了对亚胺离子的认识及应用。本研究利用239个串联质谱探索MALDI-TOF/TOF中亚胺离子的断裂特征以及它们在肽段鉴定中的应用,发现在高能碰撞诱导解离条件下组氨酸等14种氨基酸可产生较强的亚胺离子信号(>50%阳性率),氨基酸的化学结构、位置效应和氨基酸残基个数是影响碎片离子强度的主要因素。此外,探讨了亚胺离子应用过程中的假阳性问题,提出亚胺离子相对强度的比较可以降低假阳性和提高肽段鉴定确定度,有助于完善目前的数据库搜索算法和辅助从头测序分析。     

Recognition for avian influenza virus proteins based on support vector machine and linear discriminant analysis

Total 200 properties related to structural characteristics were employed to represent structures of 400 HA coded proteins of influenza virus as training samples. Some recognition models for HA proteins of avian influenza virus (AIV) were developed using support vector machine (SVM) and linear discriminant analysis (LDA). The results obtained from LDA are as follows: the identification accuracy (Ria) for training samples is 99.8% and Ria by leave one out cross validation is 99.5%. Both Ria of 99.8% for training samples and Ria of 99.3% by leave one out cross validation are obtained using SVM model, respectively. External 200 HA proteins of influenza virus were used to validate the external predictive power of the resulting model. The external Ria for them is 95.5% by LDA and 96.5% by SVM, respectively, which shows that HA proteins of AIVs are preferably recognized by SVM and LDA, and the performances by SVM are superior to those by LDA.     

应用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱建立茶叶中农药残留的筛查与确证方法

基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS),使用UNIFI软件建立91种农药残留的筛查与确证方法,进行定性方法验证并应用于流通市场中茶叶的筛查检测。通过对收集的农药认证标准物质(CRM)分析,构建91种农药化合物的质谱数据库。样品经乙腈提取,固相萃取柱净化,Acquity BEH C18色谱柱分离,在MS^E模式下进行全信息采集(ESI+), UNIFI软件对数据进行匹配分析。设置保留时间最大偏差为±0.1 min,精确质量偏差阈值为±5×10^-6,可识别加合物形式包括[M+H]⁺、[M+Na]⁺、[M+K]⁺、[M+NH₄]⁺。参照SANTE/11813/2017指南进行定性方法学验证。在21份茶叶样品中添加混合标准溶液至4个水平(0.01、0.05、0.10、0.20 mg/kg),确定每种农药在茶叶样品中的筛查检出限(SDL),共评估了1 911种农药/样品组合。发现有66种农药的SDL为0.01 mg/...     

磁性石墨烯分散微固相萃取-液相色谱-四极杆串联质谱法测定畜禽肉中9种非甾体抗炎剂

以磁性石墨烯纳米复合材料（Fe₃O₄-G）作为吸附剂,建立了磁性分散微固相萃取-液相色谱-四极杆串联质谱（LC-MS/MS）测定畜禽肉样品中9种非甾体抗炎剂（NSAIDs）残留的方法。试样经酸化乙腈均质、冷冻离心除油、乙腈饱和正己烷脱脂后,采用磁性分散微固相萃取净化。对影响萃取效率的因素（萃取时间、样品溶液的pH值和洗脱条件）进行了优化。9种非甾体抗炎剂的检出限（LOD,S/N=3）为0.2～8.2 μg/kg,定量限（LOQ,S/N=10）为0.5～25.4 μg/kg。在添加水平分别为LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ时,9种药物的加标回收率为83.3%～104.5%,相对标准偏差为1.2%～6.8%。与Sep-Pak Vac NH₂和Oasis HLB固相萃取柱相比,磁性分散微固相萃取方法富集、分离效果好,负载量大,可重复利用,为畜禽肉中非甾体抗炎剂残的测定提供了一种新的前处理技术。