辐照灭菌用于纳豆激酶制剂的实验研究

对60钴γ-射线辐照前后的纳豆激酶(NK)制剂有效成分、酶活及活菌数等技术指标进行了实验研究,结果表明,不同剂量的60钴γ-射线辐照对纳豆激酶制剂中的总皂甙含量和纳豆激酶酶活影响不大,30 kGy时总皂甙含量仍可达到原始含量的105%～125%,NK酶活达到原始酶活的90%以上;纳豆芽孢杆菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌等活菌数对60钴γ-射线辐照十分敏感,5 kGy的60钴γ-射线辐照处理后纳豆芽孢杆菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌数量下降99%以上.     

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.     

纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因，与质粒PBV220连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达，用SDS－PAGE电泳鉴定，在38kD处有一条明显的带，占菌体蛋白的20％左右，同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的纳豆杆菌基因组DN中扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到表达载体PBV220上,筛选重组子,通过限制性内切酶和PCR技术分析,初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,用凝块溶解时间法（CLT）测出表达产物具有溶解血栓活性,证明该基因可在大肠杆菌中表达,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明质粒的插入对宿主菌的生长没有太大影响,该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,但结构稳定性较差,SDS-PAGE分析结果表明基因产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

纳豆激酶液体发酵条件的优化

纳豆激酶是从日本传统食品内豆中提取出来的一种具有溶血栓功能的酶。笔者从市售纳豆中分离出一株能产纳豆激酶的菌株,并对之进行液体培养,发现在ｐＨ７．０,接种量为２％,种龄２４ｈ,装液量１０ｍＬ／１００ｍＬ,碳源为木糖,浓度为２％,氮源为大豆蛋白胨,浓度为３％的条件下,接种后第四天为产酶高峰期,最高产酶量可达到７８７．１尿激酶单位／ｍＬ发酵液。     

纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究

以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增了纳豆激酶基因（natto kinase gene）中编码前肽、成熟肽的核苷酸序列（pro-NK），构建大肠杆菌表达质粒pTYB102，转化大肠杆菌ER2566。在IPTG诱导下，分别在15℃（14h）、30℃（3h）、37℃（2h）条件下培养，pTYB102均能表达出有活性的纳豆激酶。实验证实纳豆激酶基因得到活性表达需要Pro序列。SDS－PAGE表明，15℃和30℃和37℃培养表达的杂蛋白更少。薄层扫描测定表达的纳豆激酶占菌体总蛋白30％以上。     

纳豆激酶酶学性质研究

通过测定纳豆激酶对4种人工合成底物的水解活性,以及SDS-PAGE电泳分析等,比较了两株高产纳豆激酶菌株发酵产生的纳豆激酶的酶学性质.结果发现两菌株产生的纳豆激酶的最适底物均为N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA;两菌株产生的纳豆激酶对牛纤维蛋白原的水解过程基本一致,反应不同时间,对牛纤维蛋白原不同分子质量的亚基的水解速度不同,9 h后,牛纤维蛋白原基本被全部水解.这为纳豆激酶的进一步研究奠定了基础.     

纳豆激酶酶学性质的初步研究

通过(NH4)2SO4对NK分级盐析浓缩,发现用饱和度为65%的(NH4)2SO4盐析,浓缩10倍,NK回收率最高,可达到87.1%.对其纤溶活性研究表明,NK在40℃以下时,纤溶活性相对稳定,65℃以上时,活性迅速下降;pH<4时,显著抑制NK活性;Mg2+对其纤溶活性有显著激活作用,Zn2+,Ca2+,Fe2+和Cu2+对NK有不同的抑制作用,而Al3+则使NK活性完全丧失.     

纳豆激酶纯化及性质研究

以蒸煮后的大豆为原料通过纳豆菌发酵,生产纳豆激酶.改进纯化工艺以酸法提取和凝胶过滤纯化出比活性为160.8IU/mg的酶制品.该酶制品不仅对纤维蛋白有很好的溶纤作用,而且对大鼠血纤维（拟血栓）也有很好的溶纤活性,实验还证明该酶制品对大鼠新鲜血液有很好的抗凝性能,尤其是该酶制品在pH值为2.45和经胃蛋白酶作用后仍保持较高的活力.同时,该方法制备工艺简便,有0.6%的高回收率,故本方法提取的纳豆激酶制品有望开发成为新型口服溶栓、防栓制剂,以供医疗和保健应用.     

纳豆杆菌纳豆激酶成熟肽基因的克隆与同源性分析

纳豆杆菌 (Bacillusnatto)是从日本传统食品纳豆中筛选出来的 ,它具有较强的溶栓作用 .根据已发表的纳豆激酶基因序列设计一对引物 ,利用聚合酶链式反应 (PCR) ,从纳豆杆菌的基因组DNA中扩增和克隆到纳豆激酶基因 .序列分析表明 ,该纳豆激酶基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献已报道的序列分别有 93.4 %和 94 .5 %的同源性 ,显示了极高的同源性 .但该基因与该室克隆的豆豉溶栓酶基因的同源性仅为 80 .1%,这表明纳豆激酶与豆豉溶栓酶确实不是同一种酶 .     

一种新型纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从市售纳豆中分离得到一株芽孢杆菌,命名为纳豆芽孢杆菌FDM415.提取其基因组DNA,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得含纳豆激酶编码基因的DNA片段(1179 bp);测序结果证实所分离得到的纳豆激酶编码基因NKM与文献报道(GI:29164926)的NK基因有17个碱基差异,所编码的氨基酸有3个残基不同.将该基因连接到pMG36e表达载体并导入大肠杆菌JF1125中表达,测得的纤溶酶活力为468 U/L.     

重组葡激酶的高效表达与纯化

通过发酵和纯化条件的研究,建立适合重组葡激酶工程菌的发酵和纯化工艺.对重组葡激酶工程菌发酵过程中的pH、饱和氧浓度、补料以及诱导时间进行考察,获得该工程菌的高效表达条件.在此条件下,重组葡激酶表达水平在50%以上,并以活性可溶性状态存在于细胞内;经渗滤,超滤浓缩、透析,DEAE-Sepharose FF层析和SP-Sepharose FF层析后,经SDS-PAGE和HPLC分析,纯度达到99%.在还原条件下进行SDS-PAGE分析,测得该酶相对分子质量为15.5kD,等电聚焦显示其等电点为8.4.     

纳豆激酶液体发酵条件的优化

采用比浊法连续测定D600 nm值,绘制菌种生长曲线,确定纳豆菌培养条件,并用单因素和正交设计实验的方法对纳豆激酶发酵条件进行优化,确定培养基成分的最优组合为MgSO40.02 g/L,K2HPO40.02 g/L,KH2PO40.01 g/L,CaCl20.02 g/L,麦芽糖0.3 g/mL,大豆蛋白胨0.3 g/mL,最适培养温度是37℃,pH=8.0,最佳接种量为每5 g黄豆接种500μL菌液.用Folin-酚法测酶活,由优化前的31.25 U/mL发酵液提高到158.74 U/mL发酵液,单位产量提高了约5.08倍.通过对纳豆激酶发酵培养条件的初步研究,探索纳豆激酶的生产工艺,为纳豆激酶产业化生产提供理论支持.     

纳豆激酶液体混菌发酵工艺研究

用实验室复合诱变选育的5株产纳豆激酶正向突变菌株,通过随机组合混菌发酵试验,确定了混菌发酵产NK活性最高的菌株组合为CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7和L-5-8-15.随后经过一系列正交试验和单因素试验,确定了这3个突变菌株混合发酵的最佳发酵工艺:发酵培养基中葡萄糖质量分数为4%、大豆蛋白胨4%,MgSO₄ 0.04%,CaCl₂ 0.06%,K₂HPO₄ 0.2%,KH₂PO₄ 0.1%;CBL-2-7-10-6,DNS-17-3-15-7和L-5-8-15这3个突变株接种量分别为670、670和1000μL/100 mL;初始pH7.0,发酵温度31℃,摇床转速160 r/min,发酵时间50h.在该条件下,发酵NK酶活性可以达到4 952.33 IU/mL,是本研究单菌株发酵最高酶活(DNS-17-3-15-7的NK活性2 096.57 IU/mL)的2.36倍.     

PCR扩增纳豆激酶基因的程序优化

研究了利用ＰＣＲ从纳豆菌基因组ＤＮＡ中扩增纳豆激酶基因的最优化条件，得到ＰＣＲ反应在本研究中的最重要的三个参数值为：模板量１０ｎｇ；Ｍｇ＾２＋浓度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ；退火温度６０℃。在这种优化程序下进行ＰＣＲ反应，获得了特异、高效和忠实的纳豆激酶基因产物。     

重组纳豆激酶的分离纯化及酶学性质的初步研究

将已构建好的表达载体pTYB102转化大肠杆菌,经IPTG诱导,表达出以可溶形式存在的有活性的纳豆激酶．首先对表达条件进行优化,最佳诱导温度是15℃,最佳诱导时间是10h．然后将离心收集到的菌体通过超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100柱层析以及冷冻干燥等步骤进行分离纯化,得到电泳纯的有溶栓活性的纳豆激酶．冷冻干燥品在SDS—PAGE上呈一条蛋白质带．纯化倍数35倍,纯酶比活1147．54．该酶的最适反应条件是45℃,pH8．0．酶活性在pH6．0～11．0,55℃以下稳定．     

纳豆激酶液体发酵条件的优化和调控

1987年日本学者须见洋行首先在日本传统食品纳豆中发现一种具有高效溶栓活性的酶,并将其命名为纳豆激酶（简称NK）。纳豆激酶可以降低血液中的脂肪和胆固醇,可以溶解血栓、净化血液。更重要的是,纳豆激酶等活性能物质可以渗透到毛细血管发挥作用,调节微循环,因而有祛斑美容、治疗顽固性过敏引起的皮肤病的效果。目前已经掀起了开发以纳豆激酶为主要原料的保健品热潮。本文通过对纳豆激酶液态发酵条件进行优化,改善发酵条件,在提高NK产量的同时,降低了生产成本,为工业化生产奠定了基础。     

纳豆激酶产生菌的固体发酵参数优化

对影响纳豆激酶产生菌固体发酵时产酶影响因子如碳源/氮源、含水量、温度、pH和培养时间等进行了优化.实验结果表明,菌株1适宜的固体发酵产酶培养基豆粕:麸皮比为3∶1;菌株2适宜的固体发酵产酶培养基豆粕:麸皮比为1∶1时产酶活性最高;菌株1适宜的培养基含水以50%最好,菌株2以70%最好;培养基初始pH均在7.0时酶活最高;发酵温度均以25℃最好,不易超过30℃;两个菌株的适宜发酵时间分别为36 h(菌株1)和72 h(菌株2).在优化发酵条件下,两个菌株单位发酵物中纤溶酶平均酶活力可分别达到1 407.25 U/g(菌株1)和953 U/g(菌株2).