重组人干扰素-γ的制备与鉴定

用聚乙二醇200疏水相互作用色谱固定相(PEG200-STHIC)分别在色谱柱和色谱饼上完成了一步复性并同时纯化来源于大肠杆菌(E.coli)表达的重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)。为了能使色谱分离方法用于不同来源的rhIFN-γ的纯化,对rhIFN-γ在反相色谱、离子交换色谱、固定化镍离子亲和色谱上的保留行为也进行了研究。色谱柱纯化的rhIFN-γ收集液经排阻色谱除盐和冷冻干燥得到rhIFN-γ干粉。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对rhIFN-γ干粉进行了测定,rhIFN-γ单体的相对分子质量为17184.0,二聚体的相对分子质量为34204.4。用细胞病变抑制法(CPEI)测定rhIFN-γ干粉的比活性为9.5×108 IU/mg。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定rhIFN-γ干粉的纯度高于95%。用色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ的质量回收率达到93.7%,纯度高于95%,比活性为4.3×107 IU/mg。结果表明,采用PEG200-STHIC色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ是一种十分高效的方法。     

疏水作用色谱法同时纯化及复性基因重组人干扰素-α

 使用高效疏水作用色谱直接从大肠杆菌表达的基因重组人干扰素 α(rhIFN α)包涵体的裂解液中纯化了rhIFN α ,并在纯化的同时获得了高的复性效率 ,使复性和纯化一步完成 ,大大地简化了操作步骤。用凝胶排阻色谱对该法纯化的rhIFN α进行了纯度测定 ,纯度达到 95 %以上。该法的活性回收率分别比稀释法和透析法高 1 0倍和 1 6倍。     

高效疏水相互作用色谱法复性与同时纯化重组人Flt3配体的包涵体蛋白质

Flt3配体(FL)是一类具有促进早期造血功能的细胞因子,在促进造血细胞生长发育及造血动员方面具有重要的临床应用价值。为了用基因工程方法获得大量用于临床和研究的重组人FL(rhFL)蛋白质,本文对在大肠杆菌(E. coli)中表达得到的Flt3配体的包涵体进行回收、洗涤,溶解于8 mol/L脲后在高效疏水相互作用色谱(HPHIC)柱上进行rhFL包涵体的复性与同时纯化,并对其保留特征和复性规律进行了研究。结果表明,在连续进样、变性蛋白质质量浓度为8.51 g/L、固定相选用端基为PEG800、流动相添加4 mol/L脲、1.8 mmol/L 还原型谷胱甘肽(GSH)和0.3 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSH)、pH 7.0的优化条件下,复性与同时纯化rhFL包涵体的质量回收率为36.9%,纯度达94.5%以上。本文仅用一步HPHIC法成功地复性与同时纯化了rhFL蛋白质,为获得高活性的rhFL产品奠定了一定的工作基础。     

人胃粘膜中γ-氨基丁酸和谷氨酸含量的高效液相色谱法测定

建立了胃粘膜组织中γ-氨基丁酸和谷氨酸含量的高效液相色谱测定法。用异硫氰酸苯酯(PITC)作衍生剂,色谱柱为Pico·Tag氨基酸专用柱,梯度洗脱,紫外检测波长254 nm。γ-氨基丁酸和谷氨酸分别在0.125~6.25 μmol/L,0.025～2.5 mmol/L时线性关系良好;γ-氨基丁酸和谷氨酸的平均加样回收率分别为95.4%和93.5%,批内误差分别为3.56%和1.12%,批间误差分别为7.47%和5.98%。该方法稳定、灵敏。用该方法测定了30例胃粘膜标本,结果胃癌组织的γ-氨基丁酸和谷氨     

合成的人γ-干扰素cDNA在大肠杆菌的高效表达

合成了人γ-干扰素(IFN-γ)cDNA,其特点是选用了大肠杆菌偏爱密码子。将合成基因克隆到含P_L启动子的不同表达载体中,共获得9种不同的表达质粒,它们的SD与起始密码子ATG间的距离(D)不同,在起始翻译区(TIR)的最小自由生成能△G_(f298)~°不同,故其表达量的差异也很大。其中pLY_4-γ_5表达的IFN_γ的量占菌体总蛋白的60％—80％,为国际上所罕见。表达高的原因是由于选择(D)距离适当,△G_(f298)~°较高,以及选用的密码子较好。采用十分简便迅速纯化IFN-γ的方法分离包涵体可达90％以上纯度,再经一步分子筛柱层析,IFN-γ纯度即可达95％以上,比活约2.0×10~7IU/mg。     

高效液相色谱法测定人脑脊液中γ-氨基丁酸和谷氨酸

研究了丹酰氯柱前衍生反相高效液相色谱法测定人脑脊液中γ－氨基丁酸（Ｇａｂａ）和谷氨酸（Ｇｌｕ）的方法。检测波长为ＵＶ２５４ｎｍ;流动相Ａ：甲醇;流动相Ｂ：四氢呋喃－甲醇－０．０５ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠（ｐＨ６．２）（５７５４２０,Ｖ／Ｖ）;流速为１ｍＬ／ｍｉｎ;梯度洗脱。讨论了有关测试条件。方法的线性范围分别为５～１０００μｍｏｌ／Ｌ（Ｇｌｕ）和１～６００μｍｏｌ／Ｌ（Ｇａｂａ）;最低检出限（μｍｏｌ／Ｌ）分别为０．００２（Ｇｌｕ）和０．００１（Ｇａｂａ）。     

高效液相色谱法测定生物体液中γ-氨基丁酸

研究了邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法测定血浆和脑脊液中γ-氨基丁酸的含量。色谱条件:色谱柱为Nova-pak C18柱,流动相为50 mmol.L-1的乙酸钠(pH 6.8)、甲醇和四氢呋喃(A:82∶17∶1;B:22∶77∶1,V/V),梯度洗脱。方法的线性范围为0.5~100μmol.L-1,检出限为0.04μmol.L-1。日间和日内测定的精密度分别为1.9%~6.8%和1.6%~5.7%;标准加入回收率在92.7%与96.8%之间。采用上述方法测定正常人和癫痫病患者血浆和脑脊液中γ-氨基丁酸含量,结果令人满意。     

蛋白折叠液相色谱法复性和纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞集落刺激因子

用蛋白折叠液相色谱法(PFLC)对大肠杆菌表达的包涵体形式的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行了复性并同时纯化。用Cu2+-亚氨基二乙酸（IDA） Sepharose作为固定化金属离子亲和色谱的固定相。在低浓度脲存在下,以咪唑为洗脱剂,采用线性梯度洗脱rhG-CSF。该法仅通过一步PFLC分离,减少了复性过程中rhG-CSF的聚集,复性后的rhG-CSF的比活性为1.8×108 IU/mg,纯度为97%,质量回收率为32%。     

奶粉中β-胡萝卜素的高效液相色谱法测定

使用Inertsil SIL-100硅胶柱，以正己烷等为流动相的正相液相色谱方法分析乳粉中的β-胡萝卜素收到了较好的效果．该方法的检出限、重现性、回收率和线性范围分别为：0．220μg／mL，1．88％，90．2％～95．1％和2．280～456．000μg／mL．关于采用正相液相色谱法分析β-胡萝卜素的方法未见报到．该方法具有快速，灵敏度高的特点，保留时间仅为3min左右，并大大地缩短了分析时间，提高了效率．     

高效液相色谱法中分离磷脂的流动相

一种高效液相色谱法中分离磷脂的流动相，本发明流动相的组成包括：甲醇10％-50％，乙腈50％-85％，氟代有机酸0.5％-3％，水0.5-3％。本发明流动相经长期使用，不产生任何沉淀，不会对泵系统造成损害，对液相色谱仪的泵系统未有任何损害；可以在蒸发光散射检测器中用于检测被分离的磷脂，与紫外检测器相比，检测得到的基线稳定，易于定量分析，灵敏度高，其流动相的应用不受任何限制；与梯度方法相比，使用单泵即可实现分离检测；在流动相采用合适配比时，除了可以对磷脂进行有效分离，还能分离出其他流动相无法分离的未知物质。当本发明流动相应用于等度洗脱时，操作简单、省时、重现性好、容易重复。     

分子氧氧化四氢呋喃产物中γ-丁内酯、4-羟基丁酸与1,4-丁二酸的反相高效液相色谱法测定

建立了钴(Ⅱ)配合物催化分子氧氧化四氢呋喃(THF)产物中的γ-丁内酯(GBL)、γ-羟基丁酸(GHB)和1,4-丁二酸的反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析方法。反应产物经离心、旋蒸后,以Inertsil ODS-3 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)进行分离,以0.01%甲酸-甲醇溶液为二元流动相,按流速为0.80 mL/min进行等度洗脱,采用二极管阵列检测器(波长220 nm)检测,外标法定量。实验结果表明,3种目标化合物在10.0~1 000 mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数均不小于0.999 8,方法的检出限为0.019~0.052 mg,定量下限为0.064~0.173 mg,3个加标水平下3种待测物的回收率为95%~107%,相对标准偏差(RSD)为0.09%~4.7%。该法简便、准确,可用于THF氧化产物中3种目标化合物的分析及催化剂效果评价。     

固相萃取-高效液相色谱法测定肉制品中喹乙醇

喹乙醇属于喹口恶啉类化合物,常用作饲料添加剂,具有抗菌和促生长作用[1-2]。随着对喹乙醇研究的深入,发现喹乙醇具有明显的蓄积毒性和DNA显性损伤等副作用[3],因此喹乙醇在美国和欧盟都已经被禁止用作饲料添加剂。《中国兽药典》(2005     

基于多孔石墨碳柱和正辛烷-异丙醇流动相的高效液相色谱法分离分析食用油中的甘油三酯

建立了分离食用油中甘油三酯(TAG)的高效液相色谱分析方法。使用多孔石墨碳柱(Hypercarb柱, 100 mm×2.1 mm, 5μm),以正辛烷-异丙醇(70∶30,V/V)为流动相,流速0.25 mL/min,在60℃柱温下分离,检测波长215 nm。考察了实验条件对分离和检测的影响。在优化条件下,分离了7种植物油和5种动物油中的TAG,借助质谱联用技术,识别了玉米油中14种TAG、橄榄油中9种TAG、葵花籽油中14种TAG、大豆油中14种TAG、芝麻油中15种TAG、花生油中18种TAG、菜籽油中17种TAG、鸡油中16种TAG、猪油中17种TAG、羊油中12种TAG、牛油中14种TAG和鹅油中16种TAG。在分析鸡油和牛油时,实现了SLP和SOP与其各自异构体的分离,表明本方法具有分离TAG位置异构体的能力。采样本方法分离并分析了玉米油、菜籽油、葵花籽油、大豆油、花生油、芝麻油、橄榄油中的三亚油酰基甘油三酯(LLL)的含量。本方法使用的流动相污染小、实用性较好,为食用油中的TAG及其异构体的分析提供了有价值的参考。     

反相高效液相色谱法测定人血浆中利培酮及其代谢物的质量浓度

建立了测定人血浆中利培酮及其活性代谢物9-羟利培酮质量浓度的反相高效液相色谱方法。用Zor－baxODSC18色谱柱,以V（甲醇）：V（水）：V（1mol／L醋酸铵）：V（3mol／L氨水）＝300：50：3：1为流动相,检测波长为280nm,流速为0．8mL／min。利培酮的线性范围为2～600μg／L（r＝0．996）,回收率为（98．2±3．5）％,日内与日间的标准偏差分别为4．12％和4．83％;9-羟利培酮的线性范围为2～800μg／L（r＝0．998）,回收率为（97．8±3．8）％,日内与日间的标准偏差分别为4．28％和4．81％。     

在线固相萃取-高效液相色谱法同时测定人尿液中7种多环芳烃代谢物

采用双三元液相色谱系统结合荧光检测器,建立了在线固相萃取-液相色谱法同时测定人尿液中7种多环芳烃代谢物的方法。目标化合物首先在Turboflow Cyclone固相萃取柱上在线富集浓缩,然后通过六通阀转移至Hypersil Green PAH色谱柱,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱分离,流速1.0 mL/min,柱温30℃,荧光检测器检测,分离周期为20 min。在优化的色谱条件下,5~2000 ng/L或50~20000 ng/L范围内,7种多环芳烃代谢物均呈良好的线性关系(r≥0.999),方法检出限为0.5~15 ng/L,加标回收率为80.7％~110.7％。应用本方法对吸烟和非吸烟人群尿液中7种多环芳烃代谢物的含量进行了测定,吸烟者尿液中的2-羟基萘、1-羟基萘、2-羟基菲、2-羟基芴、4-羟基菲、6-羟基显著高于非吸烟者。     

以离子液体作流动相添加剂的高效液相色谱法测定复方苦参注射液中4种生物碱

将离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(［BMIM］BF4)作为流动相添加剂建立了同时测定复方苦参注射液中4种主要生物碱的HPLC分析方法。以Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)为分离柱,甲醇-0.1%磷酸水溶液(含2.2×10-4mol/L ［BMIM］BF4)(5:95, v/v)为流动相,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,进样量20 μL,在205 nm下检测。结果表明,苦参碱、槐定碱、氧化槐果碱以及氧化苦参碱的质量浓度分别在25.8～155.0 mg/L, 40.0～240.0 mg/L, 21.7～130.0 mg/L和37.5～225.0 mg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.9990,平均回收率(n=9)在96.2%和98.9%之间。离子液体的加入能明显改善C18柱分离生物碱的色谱峰形并提高分离度。本法简便、快速、重复性好,可用于复方苦参注射液中生物碱的分离与测定。     

固相萃取–高效液相色谱法测定豆芽中4-氯苯氧乙酸钠和6-苄基腺嘌呤的残留量

建立了测定豆芽中4-氯苯氧乙酸钠和6-苄基腺嘌呤的固相萃取–高效液相色谱法。样品以0.1 mol/L的盐酸溶液为提取剂,经C18固相萃取柱净化处理,以乙腈–10 mmol/L乙酸铵水溶液(体积比25∶75)为流动相,Tech Mate C_(18)–ST色谱柱分离,4-氯苯氧乙酸钠和6-苄基腺嘌呤的紫外检测波长分别为228 nm和267 nm,色谱峰面积外标法定量。在0.50~100.00 mg/L浓度范围内,4-氯苯氧乙酸钠的相关系数为0.999 8,精密度在1.3%~8.2%之间(n=6),回收率在103.1%~109.0%之间;在0.05~10 mg/L浓度范围内,6-苄基腺嘌呤相关系数为0.999 9,精密度在0.9%~3.8%之间(n=6),回收率在88.0%~95.4%之间。4-氯苯氧乙酸钠和6-苄基腺嘌呤的检出限(S/N=3)分别为0.24,0.02 mg/kg。该法可以同时完成豆芽中4-氯苯氧乙酸钠和6-苄基腺嘌呤的分析检测。     

小鼠组织中肝靶向前药5-氟尿嘧啶含量的高效液相色谱法测定

以5-溴尿嘧啶为内标,建立了高效液相色谱法测定小鼠组织中肝靶向前药(半乳糖化人血清白蛋白与5-氟尿嘧啶偶联物)中5-氟尿嘧啶(5-FU)含量的分析方法.样品经盐酸水解、乙酸乙酯提取、离心后,取上清液在40 ℃下用N2吹干,用流动相溶解、定容后进样分析.色谱条件:安捷伦Hypersil C18色谱柱(4.0 mm×250 mm, 5 μm),流动相为甲醇-磷酸缓冲溶液,流速0.7 mL/min,UV检测波长为270 nm.方法的线性范围为1 ～20 mg/L,检出限(S/N=3)为0.1 mg/L,回收率为93% ～104%.该法操作简便、灵敏度高,适于组织中肝靶向前药半乳糖化人血清白蛋白与5-氟尿嘧啶偶联物(Gal-HSA-5-FU)的5-FU含量测定.     

反相高效液相色谱-脉冲电化学检测法测定重组人生长激素中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）-脉冲电化学检测（PED）法测定了重组人生长激素（rhGH）中的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。rhGH样品经超滤离心后,用超纯水提取,经C18色谱柱分离,用脉冲电化学器检测。结果表明,样品中添加0.02~0.10 mg/L的IPTG,其回收率为100%~102%,相对标准偏差（n=3）小于10%。在优化的条件下,IPTG的检出限可达1 μg/L（0.1 pmol,25 μL）。该方法简便高效,具有良好的灵敏度、回收率和重复性。     

高效液相色谱法测定五味子和含五味子的制剂中五味子乙素及多种活性成分时流动相体系的选择

建立了用高效液相色谱法测定五味子和含五味子的制剂中五味子乙素的流动相体系。用Shim-pack VP-ODS (250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,在柱温30 ℃、检测波长285 nm、流速1.0 mL/min的条件下,用不同的流动相组成及其不同比例研究了五味子提取液中3种木脂素(五味子乙素、安五脂素和五味子甲素)的保留时间及其分离情况,从中选择测定五味子乙素的最佳流动相体系。结果表明,在甲醇-水、甲醇-冰醋酸-水的流动相体系中,安五脂素和五味子乙素很难完全分离;而在乙腈-甲醇-水和乙腈-冰醋酸-水流动相体系中,3种木脂素可很好地分离。以乙腈-甲醇-水(体积比为17:58:25)为流动相测定五味子和护肝片中3种木脂素的含量,相对标准偏差(n4)为0.95%～5.8%,平均加标回收率为94.50%～105.6%。将该流动相体系用于供试品中3种木脂素含量的测定,分离效果好,结果令人满意。