DNA片段分选微流控芯片发展现状

新一代测序速度越来越快,费用不断降低,但整个流程中还有不少瓶颈.最耗时且影响测序准确度和重复性的环节之一,就是在文库制备过程中,对打断的大量基因组DNA片段进行基于传统凝胶电泳的手工操作筛选.近几年市场上出现了几种目标片段自动分选仪器,并迅速被多家国际知名测序中心引入测试,从而引起了广泛关注.本文评述了DNA片段分选发展经历,包括凝胶电泳、毛细管电泳、特别是微流控芯片在分选精度和通量上的不断提升,并简要论述了DNA分选目前尚存在的问题.     

单细胞与空间转录组分析研究进展

单细胞的异质性在胚胎发育、神经系统发育、癌症病变等生物学过程中具有重要的研究意义。单细胞转录组测序利用测序技术解析细胞内转录本序列,为细胞异质性研究提供可靠、准确的研究手段及观测视野,为揭示生物发育规律、疾病发生发展机制等提供了重要的技术手段。该文围绕单细胞与空间组学分析,综述了近年来发展的各类单细胞转录组测序、单细胞多组学测序及空间转录组分析方法,分析了其优缺点。同时展望了单细胞与空间转录组分析领域的发展趋势,即开发低成本、全方位、高通量、高分辨的单细胞空间多组学分析方法以实现对单个细胞更为细致、全面及准确的描述和精准单细胞图谱构建。     

微流控芯片实验室在基因分析研究中的应用

对微流控芯片实验室在基因分析中应用研究的最新进展予以综述,特别注意到了这种新技术平台在不同类型的基因多态性检测和脱氧核糖核酸(DNA)测序中的贡献,在一定程度上反映了这种贡献在临床诊断、法医学鉴定等领域已经产生的影响。     

焦测序技术及其在遗传分析中的应用

焦测序技术是一种新的实时DNA测序技术。它在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,使引物延伸聚合脱氧核糖核酸(dNTP)释放焦磷酸盐(PP i)、PP i转换三磷酸腺苷(ATP)、ATP产生荧光信号与dNTP和ATP的降解等化学反应偶联起来,检测结果准确可靠。本文综述了焦测序技术的基本原理、操作步骤和它在单核苷酸多态性(SNP)研究、微生物的分型鉴定和基因甲基化检测等遗传分析中的应用,并对焦测序技术的发展作了展望。     

纳米孔生物分子检测研究

纳米孔单分子检测技术是一种集操作简单、灵敏度高、检测速度快、无需标记等优点的传感检测技术,广泛应用于蛋白质检测、基因测序和标志物检测等领域。基因测序的费用、灵敏度和精度是该检测技术的发展中亟待解决的主要问题,而开发新型的纳米孔材料则是解决这些问题的关键手段。本文从纳米孔材料的选择和设计角度出发,综述了三种不同的纳米孔,即蛋白质等生物纳米孔、固态纳米孔和新型二维材料纳米孔在生物分子检测方面的应用现状,并比较了生物纳米孔与固态纳米孔的差别。本文也重点阐述了二维材料纳米孔在生物分子检测中的实验和模拟研究进展。最后,对纳米孔检测技术的发展前景进行了展望。     

热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。     

基于illumina测序技术的IGROV-1/CP细胞中miRNA种类鉴定及相对丰度分析

从正常培养的IGROV-1/CP细胞中提取小RNA,构建小RNA的cDNA文库,然后用illumina通用测序平台对上述cDNA文库进行测序.从测序获得的序列数据中去除冗余数据后,与已知人类miRNA序列数据库进行比对,获得IGROV-1/CP细胞miRNA表达谱.以所获的序列长度与已知人类miRNA数据库中序列长度差异不大于2和无碱基错配为限制条件,共找到53种已知miRNA.按在cDNA文库测序中的出现频率计算,出现频率不大于10的低拷贝miRNA最多,占检测到所有miRNA种类的56.6%.说明illumina通用测序技术能够在检测细胞内的各种小RNA序列的同时反应相对丰度信息,该研究利用上述新技术获得了顺铂耐药性IGROV-1/CP细胞系miRNA表达种类和相对丰度的实验数据.     

英研制出便携式基因组测序仪

据美国物理学家组织网不久前报道,英国牛津纳米孔技术公司推出GridION和MiniON两款基于新一代DNA测序技术的便携式基因组测序仪,后者仅有U盘大小,可插入电脑USB端口完成测序,价格仅900美元。     

生物纳米孔分析技术研究进展

生物纳米孔传感技术因其快速、低成本、无需荧光标记等优点,在化学和生物等诸多研究领域得到广泛应用,已发展成为一种新颖的、独具特色的单分子分析手段。该技术目前主要应用于DNA测序研究,同时在单分子分析领域也取得了令人瞩目的成就。该文简要介绍了生物纳米孔分析技术的原理和生物孔的种类,主要总结了近20年来生物纳米孔在DNA测序和单分子分析中的研究进展并予以了展望。     

植物RNA修饰的功能及分析方法

除经典碱基外, RNA中还包含许多化学修饰.迄今,已经在生命体的三域系统中鉴定出超过150种RNA修饰类型.这些RNA修饰不改变RNA的序列,但会改变其结构和生化特性,从而调节基因的时空表达. RNA修饰作为表观遗传学研究的一个重要领域,在调控植物的生长发育和胁迫应激中起到至关重要的作用.近年来,随着分析技术,特别是RNA修饰测序技术的不断进步,对植物RNA修饰的功能和机制获得了深入的认识.本文主要介绍了植物RNA修饰的功能,总结了针对这些植物中RNA修饰的分析方法,以便为今后系统地开展植物中RNA修饰的研究提供参考.     

焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计

利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时,测序信号过低或非特异性信号过高均会导致测序失败。因此,PCR引物与测序引物的设计十分重要。本研究以rs8175347为例,通过设计具有不同多聚酶亲和指数(PPI)的PCR引物,并运用焦磷酸测序测定其扩增产物,考察了PPI值对扩增效率以及测序信号的影响;以rs914232、rs671位点为例,对比不同测序方向以及dNTP的推注顺序,考察了两者对测序结果的影响。结果表明,提高PCR引物的PPI值有助于增强扩增效率与测序结果的信号峰强度,测序方向和dNTP推注顺序的不合理选择会严重干扰部分SNP测序结果的判断。因此,在设计PCR引物时,应将多聚酶亲和指数理论与传统基于解链温度值的引物设计思路相结合,为焦磷酸测序提供高质量的测序模板;在进行定量测序时,还要综合考虑待测位点(SNP)两侧的序列,选择合适的测序方向以及dNTP的推注顺序,使测序结果更加准确。     

基于克隆测序技术的人类白细胞抗原基因高分辨率分型方法的建立

运用优化的扩增和克隆测序技术,建立了人类白细胞抗原( HLA-B)基因的高分辨率分型方法。针对HLA-B基因保守区序列设计引物进行等位基因扩增,基于质粒不相容原理将杂合型等位基因有效克隆入质粒DNA中,经细菌培养后进行Sanger测序,根据测序结果经ClustalX2软件分析和IMTG/HLA数据库的BLAST比对即可完成HLA-B基因的高分辨率分型。利用建立的方法对7例临床样本进行了HLA-B基因分型,并且与第三方直接碱基序列分析基因分型技术( PCR-SBT)进行比对,结果完全一致。本方法无需专业分型软件,准确度高,成本低;采用通用引物进行等位基因的扩增和测序,无需传统方法中繁琐的引物设计和过程优化,实现了HLA-B基因的高分辨率分型。     

全血直接扩增结合焦磷酸测序法测定亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性

亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C>T和1298A>C两个位点的多态性与临床常用抗肿瘤药物甲氨喋呤及氟尿嘧啶的作用密切相关,对这两个位点多态性的检测能指导临床合理用药。为进一步缩短检测时间,降低检测成本,本研究建立了基于全血直接PCR的焦测序检测方法,采用"HpH Buffer"直接扩增全血模板,仅需1μL全血样本即可对两个位点进行高效扩增。扩增产物经碱变性法制备单链模板后进行焦磷酸测序,经过条件优化,仅需5μL扩增产物和1μL微球即可完成高灵敏的焦测序反应。为验证方法的准确性,检测了12例临床样本,均能正确检测两个位点的基因多态性。本研究为临床基因多态性检测提供了一种操作简便,耗时短,成本低,准确度高的方法,本方法可用于指导甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶的个体化用药。     

检测核酸表观遗传修饰的测序方法

生物个体中的所有体细胞享有相同的遗传信息,但具有不同的RNA表达亚群和蛋白组,在特定的时间,实际上只有部分基因被表达并执行其功能.近年来,表观遗传学研究的突破在一定程度上帮助人们理解了基因表达的调控. DNA、 RNA和蛋白质这3类生物大分子在合成后都会进行化学修饰,这些修饰几乎涉及所有生物过程的调控.迄今,已经在DNA和RNA中分别鉴定出超过17种和160种化学修饰,对DNA和RNA修饰的各种生物学功能的研究兴趣推动了表观基因组学和表观转录组学前沿领域的发展.开发化学和生物学工具来检测基因组或转录组中的特定修饰是表观基因组学和表观转录组学研究的关键,本文综述了一些常见的核酸修饰的高通量测序方法,提出现有方法中的一些瓶颈以及可能的创新方法.     

生物芯片进展*

生物芯片是近二十年来生物技术领域发展迅速和获得重大突破的高新技术,该综述介绍了经典的平铺生物芯片（DNA和蛋白质芯片）之后,重点介绍了近十年来发展的新的生物芯片的概念和内容：质谱为读出机制的表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI）芯片、高通量DNA测序技术、基于胶体光子晶体的微球高通量生物检测技术、三维阵列生物芯片技术、和微流控等生物芯片技术。描述了各种生物芯片技术的优点、应用范围、和有待解决的问题,最后展望了生物芯片技术的未来。     

高通量测序技术在水环境微生物群落多样性中的应用

微生物群落多样性的研究方法随着现代生物学技术经历了几代发展,基于形态学、生理学、分子生物学的传统研究方法在取得大量研究成果的同时,受对环境微生物群落多样性认识的限制,亟待获得一种能更加全面、准确、快速反映环境微生物群落结构的方法。本文首先回顾了传统研究方法,重点介绍了高通量测序技术,包括研究者所关注的测序仪分布、类型、原理、优势与制约,列举了多样性研究中的分析作图软件,最后以454的焦磷酸测序为例具体阐述了该方法在分析水环境微生物群落多样性中的应用。     

碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量

建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称"SRPP").先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签,PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码,使得测序结果中的序列代表基因的来源,峰高代表基因在不同来源中的相对表达量.用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证,结果表明,SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量,并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异.     

纳米孔分析化学

源于自然界,服务于人类社会的纳米尺度装置包括生物及人工制备的纳米孔与纳米通道等。基于这些纳米尺度装置的分析化学简称纳米孔分析化学。本文对纳米孔分析化学的发展,特别是近年来在DNA测序、蛋白质分析的进展进行了综述,对于纳米孔分析化学发展的历史、基本分类、原理和应用作了介绍与展望。     

高通量测序技术在水环境微生物群落

微生物群落多样性的研究方法随着现代生物学技术经历了几代发展,基于形态学、生理学、分子生物学的传统研究方法在取得大量研究成果的同时,由于对环境微生物群落多样性认识的限制,亟待获得一种更加全面、准确、快速,反映环境微生物群落结构的方法。本文首先回顾了传统研究方法,重点介绍了高通量测序技术,包括研究者所关注的测序仪分布、类型、原理、优势与制约,列举了多样性研究中的分析作图软件,最后以454焦磷酸测序为例具体阐述了该方法在分析水环境微生物群落多样性中的应用。     

基于石墨烯纳米材料的DNA测序研究进展

设计和研发快速、准确、价廉、高通量的DNA测序方法,对于预防早期疾病和了解相关疾病机理具有非常重要的意义。新型纳米材料石墨烯由于具有独特的结构和性质,在化学和生物科学等领域发挥着重要的作用。该文介绍了DNA测序的研究现状以及应用石墨烯纳米材料的优势,重点阐述了DNA链通过石墨烯纳米孔、石墨烯纳米间隙、石墨烯纳米带时产生不同的电流信号识别碱基序列的原理,同时介绍了DNA链与石墨烯的相互作用对DNA测序的影响,并对DNA测序的研究方向进行了展望。该文为基于石墨烯纳米材料的DNA测序提供了作用原理、理论研究以及检测方法等参考。