E.coli PC+PE-菌株AD93/ptac67的构建及其生物学性质

将螺旋菌Borrellia.afzelii编码的磷脂酰胆碱合成酶基因(pcs)导入磷脂酰乙醇胺阴性菌株E.coli AD93(PE-)获得磷脂酰胆碱阳性、磷脂酰乙醇胺阴性的菌株E.coli AD93/ptac67(PC+PE-).生理生化特性调查显示:AD93/ptac67菌株的生长需要高于10 mmol/L的Mg2+,而对照细菌AD93则需要高于20 mmol/L的Mg2+,AD93/pDD72菌株则不需要;AD93/ptac67与AD93 SDS的MIC值为0.02%,比AD93/pDD72低约10倍;5%NaCl完全抑制AD93/ptac67的生长,3%NaCl则几乎完全抑制AD93的牛长,而NaCl浓度为5%时,AD93/PDD72菌株仍能牛长;SDS-PAGE图谱显示3种菌株的周质蛋白差异显著,而外膜蛋白差异不明显.在活体细菌中,磷脂酰胆碱替代磷脂酰乙醇胺并不能使缺少磷脂酰乙醇胺的突变体恢复至野生型状态,显示磷脂酰胆碱不能完全替代磷脂酰乙醇胺的功能.     

北美海蓬子胆碱单加氧酶基因CMO的克隆及表达研究

胆碱单加氧酶(CMO)是合成植物小分子非毒性有机渗透调节物质甜菜碱过程中重要的限速酶.文中采用RACE技术以北美海蓬子为实验材料克隆CMO基因的全长c DNA序列(Genbank登录号:KM884944),并做相关的生物信息学分析.研究结果表明,该基因c DNA全长1 834 bp,其中开放阅读框(ORF)有1 317 bp,编码439个氨基酸,预测其蛋白分子量为49.537 k Da,理论等电点(p I)为6.15;序列分析显示北美海蓬子CMO蛋白中含有2个重要的保守域和功能域,不存在跨膜区域;除了与蒺藜苜蓿及水稻的同源性分别为46%和49%外,与其他植物CMO蛋白序列相似性均达到55%以上;系统进化树分析显示,它与欧洲海蓬子的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,随着Na Cl浓度的升高,北美海蓬子CMO基因的表达量增加,说明该基因可通过盐胁迫诱导表达.     

黑虎虾Crustin的克隆表达纯化及抑菌活性测定

从黑虎虾血淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码Crustin成熟肽的cDNA序列,将其克隆至pMD18-T载体进行扩增,然后克隆到pET-32a(+)表达载体中,转化至E.coliOrigamiTM(DE3)中表达Crustin抗菌蛋白,后通过Ni2+亲和层析柱纯化获得Crustin蛋白,采用滤纸片扩散法检测该蛋白的抑菌活性     

对虾肽Penaeidin-2在大肠杆菌中的融合表达及其抗细菌活性

采集南美白对虾血淋巴,从血细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码penaeidin-2成熟肽的开放阅读框cDNA序列,将其克隆至pGEM-T载体,进行序列测定,然后克隆至pET-32a(+)表达载体中,在E.coliOriga-mi B(DE3)pLysS中表达含6个His的重组对虾肽融合蛋白Pen-24,通过His Band resin Ni2+层析柱纯化获得Pen-24蛋白,采用纸片扩散法和液体生长抑制法检测该蛋白的抑菌活性.经SDS-PAGE分析,Pen-24蛋白的分子量为24.1×103.1μg对虾肽融合蛋白Pen-24与5 U的氨苄青霉素活性相当,对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和抗氨苄青霉素大肠杆菌均具有抑菌活性.     

人t-PA P区在大肠杆菌中表达及其活性研究

用PCR方法获得编码人组织型纤溶酶原激活物（tissure-typeplasminogenactivator,t-PA）C端P区肽段的DNA,并经测序证实,长810bp,含有全部的t-PA的丝氨酸蛋白酶编码序列.将这段序列克隆到表达载体pQE30中转化大肠杆菌JM109菌株,经SDS-PAGE检测转化菌株中表达出分子量约29×103的蛋白,用纤维平板法测定激活纤溶活性,结果表明表达的t-PA蛋白C端P区具有很强的激活纤溶蛋白酶原的活性.证实t-PA蛋白C端P区的酶结构区的功能是独立的,其生物活性不受其它区域影响．     

LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

分别从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中扩增ltB和hpaA基因,构建ltB-hpaA融合基因及其原核表达系统,鉴定其表达产物的免疫原性、佐剂活性及其对Hp SS1株感染小鼠的保护作用.采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增hpaA基因和ltB基因片段,构建ltB-hpaA融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列.采用质粒pQE32和宿主菌E.coli M15构建ltB-hpaA融合基因表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达.采用western blot和GM1-ELISA鉴定表达产物的抗原性、免疫反应性和佐剂活性.建立HpSS1株感染BALB/c小鼠模型,检测rLTB-HpaA的免疫保护效果.采用ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中HpaA抗体和41株Hp临床菌株HpaA表达情况.与GenBank登录的相关序列比较,所构建的ltB-hpaA融合基因核苷酸序列同源性分别为94.25%～99.71%和95.38%～99.19%.所构建的表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15的目的重组蛋白(rLTB-HpaA)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右.rLTB-HpaA能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能产生特异性抗体.GM1-ELISA结果显示rLTB-HpaA能与牛GM1结合.rH-paA免疫小鼠的保护率仅为66.7%,rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3%.81.6%患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性,所有菌株均含有HpaA.本文成功地构建了itB-hpaA融合基因高效原核表达系统,所表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性,并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用.     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

与HBV X蛋白相互作用的细胞蛋白的筛选及其鉴定

参考GenBank核苷酸序列库中的HBV的核苷酸序列设计合成了一对对应于HBx基因的引物，从原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者的血清中提取HBV基因组DNA作为模板，扩增HBx编码区并测定了核苷酸序列．将该编码区克隆到酵母双杂交系统的诱饵蛋白表达载体pGBKT7中，转入酵母细胞AH109，进行表型鉴定．然后通过Mating实验从已制备好用于酵母双杂交系统的肝cDNA表达文库中筛选与HBx相互作用的细胞蛋白，并用体外免疫共沉淀实验进一步验证．研究表明，分离得到的与HBx基因编码的蛋白相互作用的4种新的细胞蛋白，分别是醛缩酶B、C8α亚基、一种丝氨酸蛋白酶Hepsin和一种未知蛋白．     

一种新的烟草钙调素结合蛋白的分离鉴定

用^35S标记的钙调素(^35S-CaM)作探针，从烟草cDNA文库中筛选到一个cDNA克隆pTCB40．DNA测序表明，分离的cDNA片段具有的开放阅读框编码233个氨基酸的多肽链．所编码钙调素结合蛋白TCB40(CaM—binding protein，CaMBP)与离子通道蛋白的同源性高达81％．凝胶覆盖实验结果证明其表达的蛋白具有依赖Ca^2 的钙调素结合活性。缺失分析表明钙调素结合位点于其蛋白的C端。Northern blot分析发现，TCB40在烟草茎，叶和花中均表达，但在叶中的表达量明显高于其他器官。     

B组轮状病毒WH-1株nsp2基因的原核表达与抗体制备

根据B组轮状病毒(GBRV)WH-1株nsp2基因的全序列,设计引物,用PCR的方法扩增得到nsp2基因的编码区.将其片段克隆到原核表达载体pGEX-KG上,经IPTG诱导,在E.coliDH5α菌株中得到高效表达.表达的GST融合蛋白大小为61×103,经SDS-PAGE分离纯化,免疫小白鼠制备了多克隆抗体.抗体经1∶3 000倍稀释后用于Western Blot分析,获得特异性显色信号.所表达的蛋白和制备的抗体可用于蛋白结构和功能的进一步研究.     

人新型肿瘤坏死因子在E.coli中的 高效表达、纯化及诱导凋亡活性

采用PCR技术获得了新型的人肿瘤坏死因子基因,在153位氨基酸处引入突变,使Gly突变为Leu.将突变体hTNF基因克隆到表达载体pQE30中,SDS-PAGE结果显示经IPTG诱导后,hTNF基因获得大量表达.通过Ni金属鳌合层析柱亲和层析获得到纯化的hTNF融合蛋白,Westernblot结果表明hTNF蛋白可与抗TNF的抗血清发生特异性反应.荧光染色实验检测了hTNF蛋白诱导细胞发生凋亡的活性.     

黄杆菌(Flavobacteriumsp.)ATCC27551 opd基因在E.coli中的克隆及表达

研究了黄杆菌 ATCC2 75 5 1的 opd基因在大肠杆菌中的表达 ,并对于表达产物进行了胞内定位和酶活测定 .通过 PCR扩增和 PCR产物直接克隆 ,将黄杆菌质粒上的一段长达 1137bp的 opd基因进行扩增及克隆 ,然后按正确的读码框亚克隆于表达载体 p ET2 8b( )上 ,转化宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3) ,经 IPTG诱导 ,获得了较高量的基因表达产物 .该表达产物以包涵体的形式存在于细胞内 ,通过分离包涵体可以得到电泳较纯的条带 .工程菌的细胞活性达到原始菌株黄杆菌的水平     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.     

鹌鹑和黑斑蛙核糖体蛋白L15 cDNA片段的克隆和序列分析

通过R-PCR方法、分别从两栖类的黑斑蛙(Rana nigromaculata)和鸟类的鹌鹑(Coturnix coturnix japonica)中首次克隆了核糖体大亚基蛋白Ll5(RPL15ribosomal protein L15)的cDNA片段,并分析了其序列特征,黑斑蛙和鹌鹑的rpll5cDNA片段分别为467个核苷酸和408个核苷酸，推测分别编码155个氨基酸和136个氨基酸的蛋白片段，与其它已知的脊椎动物，rpl15序列有高度的同源性．应用这两条cDNA序列和其它已知的脊椎动物rpll5序列构建的系统发育树显示聚类结果与传统分类一致。     

纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备

纳豆激酶是一种源于日本传统食品纳豆且具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶．本研究将编码信号肽、前导肽和成熟肽在内的纳豆激酶基因克隆到原核表达载体pET28a^＋中,获得重组表达质粒pETNK．将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达．SDS-PAGE结果显示纳豆激酶在大肠杆菌中成功表达,表达的纳豆激酶融合蛋白分子量大约为31kD．亲和层析法纯化表达产物,并以此纯化产物作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗纳豆激酶血清,用ELISA和Western blotting对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定．纤维蛋白平板实验显示,表达的纳豆激酶融合蛋白具有较好的溶纤活性．     

重组甲鱼载脂蛋白B的研制及其阻断STSSSV感染的活性初探

为了制备甲鱼(Pelodiscus sinensis)载脂蛋白B (Pelodiscus sinensis Apolipoprotein B, PApoB) 基因的原核表达产物, 并探索其是否具有阻断甲鱼系统性败血症球状病毒(Soft-shelled Turtle Systemic Septicemia Spherical Virus, STSSSV)感染的功能, 为最终控制和防治甲鱼系统性败血症疾病奠定基础, 构建了PApoB的原核表达系统, 纯化了重组PApoB, 并将其用于阻断STSSSV感染的分析: 根据甲鱼PApoB的基因序列, 设计引物, 扩增其第9932-11209bp(3294-3696 aa)区段, 将其连接至表达载体pET-28a(+)中, 转化大肠杆菌Rosetta株, 经硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达, 并用亲和层析法纯化获得了重组PApoB; 将FITC标记的STSSSV与PApoB孵育后对甲鱼细胞进行攻毒, 显微镜下观察, 结果PApoB添加组的病毒荧光信号明显低于非添加组, 表明该重组蛋白可以阻断STSSSV的感染.     

嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的克隆及其表达

报导了以启动子探测质粒pKK232-8为载体克隆嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的研究.用限制性内切酶Hindl分别消化嗜碱芽孢杆菌NTT89染色体DNA和质粒pKK232-8,在体外重组,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,在含氨苄青霉素和氯霉素的选择性平板上筛选转化子,结果从NTT89染色体DNA中克隆到一系列带有启动子活性的DNA片段,并在大肠杆菌中得到表达,这些转化子抗氯霉素水平在34～500mg/L不等,随机挑选10个转化子,提取其重组质粒进行限制性酶切,表明转化子中的重组质粒外源片段插入的效率很高,插入片段大小在500～5500bp之间,通过地高辛标记的点杂交和Southern杂交均证明重组质粒上插入的具启动子功能的DNA片段来自于嗜碱芽孢杆菌的染色体DNA.     

微量热技术检测古生菌启动子DNA片段的启动功能

用微量热法研究了大肠杆菌HB101及其重组菌株的代谢特征．将不同大小的来源于嗜盐古生菌染色体DNA的启动子片段插入启动子探针载体中的氯霉素抗性基因前，获得重组菌株．结果表明重组菌株的半抑制浓度与DNA片段的启动功能大小是一致的，并且质粒的复制几乎不影响菌株的生长及代谢．培养基中加入氯霉素后，启动子启动氯霉素抗性基因表达，生长速率(k)降低，最大峰的出现时间(tp)延长，最大峰值(pm)也随之降低．在一定范围内，抗生素浓度与tp、pm呈线性关系．本研究结果直接证明了来自嗜盐古生菌的RM07、RM08和RM13片段在大肠杆菌中是有启动功能的，而且还表明基因表达量的高低与释放的代谢热变化相一致．因此微量热技术有可能为检测古生菌基因表达及其调控以及揭示古生菌这一特殊生命体的遗传和代谢特征提供一种新的灵敏的方法．