亲和毛细管电泳的研究与应用

近年来,由于毛细管电泳技术理论的不断完善,亲和毛细管电泳技术得到迅速发展,并在生命科学、生物技术、临床医学、药物学等领域具有广泛的应用.对亲和毛细管电泳的原理、优点及分类做了简要介绍,并且着重介绍了近几年ACE技术在蛋白质分析、核苷酸分析、药物分析、手性分离及小分子、离子分析等方面的研究进展,及其在亲和常数测定、蛋白质结构分析、核苷酸的检测中的应用.     

免疫亲和毛细管电泳的研究进展

免疫亲和毛细管电泳方法结合了免疫分析的高特异性和毛细管电泳分离的高效、快速、样品用量少等优点,是复杂样品中特定组分分析的重要方法之一。激光诱导荧光检测器的使用以及毛细管电泳分离前免疫预富集过程的引入,可以进一步提高分析测定的灵敏度,使其能够用于痕量物质的高灵敏测定。本文结合作者所在课题组的工作,对免疫亲和毛细管电泳的两种主要模式,即均相的毛细管电泳免疫分析(CEIA)和非均相的免疫亲和毛细管电泳(IACE)的研究进展进行了综述。     

毛细管电泳与芯片毛细管电泳的双检测技术

综述了毛细管电泳和芯片毛细管电泳的3种双检测技术,包括荧光-散射等光学双检测技术、安培-非接触电导等电化学双检测技术和荧光-非接触电导等光电联用双检测技术.介绍了3种双检测方法的仪器的检测原理及应用,并展望了双检测技术的发展前景.引用文献54篇.     

亲和毛细管电泳研究生物分子的手性识别*

结合作者研究组近年来对毛细管电泳的系统研究,评述了亲和毛细管电泳方法研究生物分子的手性识别进展。简要介绍了该领域研究的意义、原理,列举了含有蛋白、抗生素、糖及核酸等4种重要生物分子的作用体系及一些应用,并展望了该领域的发展潜力及前景。     

亲和毛细管电泳法研究锌离子与人血清白蛋白的结合反应机制

建立了研究金属离子与人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)相互作用的亲和毛细管电泳(Affinity capillary electrophoresis,ACE)方法。生理条件下,构建配体(Zn2+)-受体(HSA)相互作用模型,以N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)为内标物,基于Scatchard方程,依据有效淌度的变化,通过非线性模拟方程计算Zn2+-HSA结合反应的表观结合常数KB,定量表征了Zn2+-HSA相互作用的强度,并解析电泳谱图获得了Zn2+-HSA结合反应为一快平衡体系的结论。结果表明,建立的ACE方法简捷、有效,Zn2+-HSA相互作用的强度与Zn2+浓度之间存在明显的量效关系。     

亲和毛细管电泳间接紫外检测法测定金属络合物的亲和常数

 采用亲和毛细管电泳间接紫外检测方法 ,根据“峰漂移”模型 ,通过迁移时间的测定 ,可以获得在水体系中有极低亲和常数的金属络合物的亲和常数。将该方法分别应用于镁离子 柠檬酸体系和锰离子 酒石酸体系 ,在 pH为 5 .0 1,运行电压为 2 0kV ,缓冲溶液组成为咪唑和醋酸的条件下 ,测定了缓冲溶液中加入不同浓度配体后金属离子迁移时间的变化 ,经过数据处理后得出它们的亲和常数对数值分别是 3.2 7和 2 .2 8,与文献值较为一致。该方法适用于结合比为 1∶1的金属络合物的亲和常数的测定。     

软骨藻酸作用蛋白质的亲和毛细管电泳筛选

基于亲和毛细管电泳,定性比较了血浆、肠道及细胞线粒体中所选的9种重要功能蛋白质与神经毒性生物毒素--软骨藻酸(domoic acid, DA)的相互作用。以DA淌度比变化量 Δ M与蛋白质浓度L作图,根据斜率值大小可比较DA与蛋白质作用的相对强弱。结果如下:可与DA相互作用的有6种蛋白质,作用强弱为:人凝血酶 > 细胞色素C≈胰蛋白酶≈免疫球蛋白E (Ig E) ≈核糖核酸酶A > λ 核酸外切酶;而铁蛋白、转铁蛋白、凝集素与DA未表现出相互作用和亲和力。实验表明,亲和毛细管电泳具有高效、快速、所需样品量低的优点,可用于DA作用靶蛋白的筛选,为DA的毒性机制研究和毒性防护提供基础信息。     

毛细管电泳用于胞嘧啶脱氨反应动力学研究

DNA中的胞嘧啶在化学致变剂作用下会发生脱氨反应，被认为是导致基因损伤的重要原因之一，本文采用毛细管电泳测定胞嘧啶和尿嘧啶，并将此种新方法用于过氧化氢存在下胞嘧啶脱氨反应的动力学研究，结果显示该反应对过氧化氢和胞嘧啶均为一级反应，反应活化能为70.35kJ.mol^-1，明显低于自发脱氨反应，表明过氧化氢可以加速胞嘧啶脱氨反应。     

亲和毛细管电泳测定孕酮与其单克隆抗体的结合常数

采用亲和毛细管电泳的配体分离模式,以激光诱导荧光作为检测手段,测定了荧光素标记的孕酮与孕酮我隆抗体之间的结合常数,并研究了温育时间、电泳条件等因素对测定的影响。     

Ca2+与乳清蛋白结合的亲和毛细管电泳研究

利用亲和毛细管电泳研究了Ca²⁺与α-人乳清蛋白(α-HLA)的结合情况.以恒定浓度α-HLA作为受体,运行缓冲溶液加入不同浓度的Ca²⁺作为配体,可观察到由于Ca²⁺的结合,α-HLA的电泳淌度发生了变化.通过Scatchard方程的淌度比(M)处理数据得到α-HLA与Ca²⁺的表观结合常数(K_app)为2.0×107(mol/L)^-1.同时考察了Ca²⁺对变性剂(尿素)和热诱导所引起的α-HLA去折叠的影响,结果表明,Ca²⁺的结合增强了α-HLA的稳定性,也即提高了α-HLA抗变性剂和热诱导的去折叠性能.     

一类酶反应底物的光化学荧光研究

研究了对位取代酚类酶反应底物的光化学荧光反应机理，指出光子不仅可以取代过氧化物酶，而且可以取代氧化剂（Ｈ_２Ｏ_２）。用于测定多种酶反应底物，结果满意。     

毛细管电泳用于评价脱氧核糖核酸退火反应

将毛细管电泳技术用于定性和定量评价互补单链脱氧核糖核酸（DNA）的退火反应，从电泳信号能直接观察退火效率。解释了双链DNA的电泳迁移特性，对DNA产品基质中的NaCl浓度进行了测定，考察了DNA样品中NaCl浓度对进样的稀释效应。在所应用的实验条件下，NaCl浓度在20mmol/L以内稀释效应的影响是可以忽略的。     

毛细管电泳紫外检测聚谷氨酸发酵液中蔗糖浓度

建立了测定发酵液中蔗糖浓度的新方法———毛细管电泳紫外法。考察了该方法中背景缓冲液的选择、分离电压、温度等因素对样品响应值和迁移时间的影响,获得了优化的电泳工作条件。最佳的操作条件为:以30 mmol.L-1、pH 11.0的对氨基水杨酸作为背景缓冲液,分离电压15 kV,操作温度25℃。在此条件下,电泳分离在6.66 min内完成,标准曲线的线性范围为0.078~20 g.L-1、r为0.999 8、检出限为0.035 g.L-1。应用该方法测定聚谷氨酸发酵过程中不同生长时期蔗糖浓度和消耗曲线。     

毛细管区带电泳用于酶微反应器酶解条件的研究

将氨基酰化酶通过戊二醛固定在毛细管内壁,制备毛细管酶微反应器,用毛细管区带电泳对毛细管酶微反应器的酶解产物进行分离,以生成物的峰面积优化底物N-乙酰-DL-蛋氨酸的酶解条件。实验结果表明,在温度37℃的条件下,10μg/mL N-乙酰-DL-蛋氨酸磷酸盐缓冲溶液(pH7.5)以4μL/min的速度通过15 cm长的毛细管酶微反应器,具有良好的酶解效果。利用毛细管酶微反应器对底物N-乙酰-DL-蛋氨酸进行酶解,每天酶解5次,10天后酶活仅下降了8.66%,说明制备的毛细管酶微反应器具有良好的稳定性。     

毛细管电泳柱端酶微反应器研究进展

微反应器是指使物理、化学、生化等反应在微小的空间内发生的装置。微反应器能减少试剂消耗和样品污染,且反应条件易于控制,特别适合于酶促反应分析,因而多为酶微反应器。微反应器与电泳联用时,可将毛细管柱端作为微反应器,集反应与分离于一根毛细管柱上,可实现反应与分离一次性完成。根据酶微反应器制备原理的不同进行分类,综述了近2年来毛细管电泳柱端酶微反应器的研究进展。     

阿魏酸转化反应速率常数的毛细管电泳测定方法研究

初步确定了阿魏酸自然转化产物的结构 ,并用毛细管电泳测定了转化反应速率常数。在常温下 ,用毛细管区带电泳法直接测定阿魏酸浓度随时间变化的规律 ,并根据HPLC -MS -MS得到的质谱图及紫外光谱图初步确定了转化产物。在23℃ ,阿魏酸转化反应正向和逆向反应速率常数分别为5.194×10 -6s -1、5.360×10 -6s -1。方法简单、灵敏、快速     

软骨藻酸作用蛋白质的亲和毛细管电泳筛选北大核心CSCD

基于亲和毛细管电泳,定性比较了血浆、肠道及细胞线粒体中所选的9种重要功能蛋白质与神经毒性生物毒素——软骨藻酸(domoic acid,DA)的相互作用。以DA淌度比变化量ΔM与蛋白质浓度L作图,根据斜率值大小可比较DA与蛋白质作用的相对强弱。结果如下:可与DA相互作用的有6种蛋白质,作用强弱为:人凝血酶>细胞色素C≈胰蛋白酶≈免疫球蛋白E(Ig E)≈核糖核酸酶A>λ核酸外切酶;而铁蛋白、转铁蛋白、凝集素与DA未表现出相互作用和亲和力。实验表明,亲和毛细管电泳具有高效、快速、所需样品量低的优点,可用于DA作用靶蛋白的筛选,为DA的毒性机制研究和毒性防护提供基础信息。     

毛细管电泳研究最新亮点

1无机多聚磷酸盐的毛细管凝胶电泳分析多聚磷酸盐是一种由几个至数百个磷酸残基相互聚合形成的线性多聚体,广泛存在于自然界的无机环境和细菌、真菌等低等单细胞生物和高等哺乳动物等生命有机体中。多聚磷酸盐分析是探寻地球生命的化学和生物起源的基本研究内容。传统的多聚磷酸盐分析主要采用凝胶电泳和凝胶染色检测,方法烦琐,耗时长。采用阴离子交换色谱结合电导检测,对磷酸盐聚合度应用范围较窄。多聚磷酸盐的毛细管电泳分析主要采用涂层毛细管和管内填充线性聚丙烯酰胺筛分介质的方法,其在毛细管的重复使用、方法的重现性以及高聚合度多聚磷酸盐的分析中存在不足。Whitesides等用低黏度的聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)作为毛细管凝胶电泳介质,以对苯二甲酸盐为背景吸收电解质,通过优化背景电解质的pH等手段实现了聚合度可达70的聚磷酸盐的高分辨分离和间接灵敏检测。通过在出口端样品瓶中加入聚乙二醇(PEG)与毛细管内溶液密度平衡,使分离电流稳定,重现性提高。该方法简单、方便,并可拓展用于其他无生色团的生物高分子多聚阴离子混合物(如硫酸多糖、低聚磷酸盐二酯、磷壁酸、透明质酸、磷酸软骨素等)的高分辨分析检测。详见: Anal Chem, 2010, 82: 6838～6846。 2压力辅助的毛细管电泳超快速分析红细胞样品中的腺苷酸组分腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)和腺嘌呤核苷单磷酸(AMP)组成了生物体中的腺苷酸系统,它们在生物体中起重要的生物功能作用。ATP是体内组织和细胞的一切生命活动所需能量的直接来源,生命活动的过程中活细胞内部时刻进行着ATP与ADP的相互转化,同时也伴随着能量的储存和释放。3种腺苷酸还参与蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成,并具有促使机体细胞的修复和再生、增强细胞代谢活性等作用。应用液相色谱分析3种腺苷酸所需的时间为30～45 min。基于3种腺苷酸具有明显不同的负电荷性质,采用毛细管电泳可对其进行快速的分离分析。Zinellu等在前期短端进样快速分析(Electrophoresis, 2008, 29: 3069)的基础上,创建了电泳过程中同时加压辅助电泳分离的超常规压力/电压技术。他们使用了贝克曼公司配有二极管阵列检测器(DAD)的MDQ CE 系统。分离在20 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH 3.8）、30 ℃、 25 kV(120 mA)、反向电压（正极为出口端）条件下进行,电泳分离的同时由进样端（负极）向出口端（正极）施加1.378 kPa (0.2 psi)的压力。为避免ATP的水解,他们还对采用酸沉淀方法提取红细胞中腺苷酸的条件进行了优化。采用此方法,3种腺苷酸可在1.5 min内实现高分辨分析,20个红细胞样品的测定可在60 min内完成。该方法可用于临床实际样品中ATP的准确和高通量的超快速分析。该方法也对开发商用毛细管电泳仪的电泳和压力双功能分离作用提供了新的思路。详见: Electrophoresis, 2010, 31: 2854～2857。 3包埋纳米金的聚阳离子涂层毛细管电泳和硼掺杂金刚石电极电化学检测的尿液生物标志物的电泳分析体液中与疾病相关的生物标志物的发现和分析是近年来生物医学分析检测中的重要内容之一。尿液中香草扁桃酸(VMA)和高香草酸(HVA,儿茶酚胺代谢物)含量及相对比值的分析有助于对疾病发展阶段、肿瘤发展、儿童的神经母细胞瘤的预测。发展尿液和其他生物样品中生物标志物的快速灵敏的分析方法具有重要的临床意义。Luong等提出在色氨酸和其他8种重要的多巴胺和吲哚胺类物质共存时检测3-吲哚硫酸盐(IXS,色氨酸代谢物)、HVA和VMA的毛细管电泳分析检测新方法。通过包埋在聚二烯丙基二甲基氯化铵的纳米金(27 nm)对毛细管内壁的涂层修饰,形成稳定的内壁涂层。该涂层使电渗流反向,使IXS、HVA和VMA快速迁移,而其他内源性化合物抗坏血酸、尿酸、儿茶酚胺和吲哚胺的迁移滞后。该涂层的性质稳定,提高了上述多种分析物分离的分辨率。此外,该毛细管电泳分析中使用热丝化学气相沉积构建的硼掺杂金刚石电极对分析物进行了高灵敏的电化学检测,该电极在反复用于实际尿样分析后也不会被污染。详见: Anal Chem, 2010, 82: 6895～6903。 4毛细管区带电泳表征接枝和非接枝乳清蛋白的氧化铁核/硅壳纳米粒子当今的生物医学分析检测中越来越多地引入纳米粒子。大家所关注的除量子点外,超顺磁性的氧化铁纳米粒子因在磁共振影像中作为造影剂,在热疗治疗、药物输送、肝细胞分离和纯化、荧光细胞标记以及脱氧核糖核酸(DNA)纯化中得到了广泛的应用。所有这些应用都需要对纳米粒子进行表面修饰。在前期的研究中,毛细管电泳方法主要用于表征生物大分子接枝的量子点纳米粒子。Varenne等报道了氨基酸/PEG双功能基团修饰的氧化铁核/硅壳的纳米粒子表面接枝α-乳清蛋白和非接枝蛋白纳米粒子的毛细管电泳表征和分离方法。利用DDAB(didodecyldimethylammonium bromide)动态涂层或HPC(hydroxypropylcellulose)永久涂层修饰的毛细管,研究了使胶体溶液稳定并可与后续免疫分析兼容的优化分离条件,如温度、溶液pH、离子强度和电场强度等。纳米粒子的分散和聚集状态可由毛细管电泳轮廓图清晰表征;接枝蛋白和非接枝蛋白纳米粒子在10 mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)/NaOH(pH 6.0)溶液中,在18～60 ℃范围内保持稳定,温度对二者的Zeta电位没有明显的影响;在不同pH(pH 4.5～8)缓冲液体系中,接枝蛋白和非接枝蛋白纳米粒子的迁移率差别不明显,仅当溶液的pH=4(小于乳清蛋白的pI)时,因接枝蛋白表面带正电荷,接枝蛋白纳米粒子的迁移率显著大于非接枝蛋白纳米粒子。考虑后续为适应抗原-抗体反应和接枝蛋白存储的稳定性,pH 6是最佳的选择;在电泳分析中,应用两种不同涂层的毛细管进行分离,电场强度对接枝蛋白和非接枝蛋白纳米粒子的影响有所不同:DDAB涂层的毛细管适合采用低电压分离,而HPC涂层的毛细管适合采用高电压分离。离子强度影响纳米粒子的稳定性和聚集状态,影响接枝蛋白和非接枝蛋白纳米粒子的聚集形成,并对两种粒子影响的阈值不同(接枝蛋白＞30 mmol/L,非接枝蛋白＞100 mmol/L)。该方法表明,毛细管电泳是表征纳米粒子功能化修饰过程随着时间、溶液条件等变化的简单有效的方法,在肉眼尚不能观察到其变化的时间(1～2 d)内,可以准确灵敏地检测其修饰和聚集状态,是纳米粒子常规表征方法的一种简便、快速和可行的替代方法。详见: Electrophoresis, 2010, 31: 2754～2761。