人泡沫反转录病毒(HSRV)的研究进展

扼要介绍了近年来人泡沫反转录病毒(HSRV)研究的进展,包括病毒形态、基因组结构、病毒蛋白质及其转录特性,并对HSRV与疾病的关系和HSRV构建反转录病毒载体的基础进行了分析.     

人泡沫逆转录病毒介导的siRNA抑制HBV基因表达与复制

本研究采用基于PCR技术的siRNA表达方法,快速筛选到两个可以抑制HBV基因表达的siRNAs序列:S2和X1.S2和X1被克隆到人泡沫逆转录病毒(human foamy virus,HFV)载体中,构建成为分别表达S2和X1的单表达载体和同时表达S2和X1的双表达载体.将siRNAs表达载体转导入HepAD38细胞系中,多种检测分析的结果表明这些siRNA表达载体可以有效抑制多个HBV基因的表达和病毒DNA复制;并且其抑制作用是长期的,可以持续到转导后3个月.     

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒P△GP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSVl3的基础上，缺失突变gag和pol基因，并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR，构建辅助质粒p△GP．将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-EGFP和辅助质粒pAGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系，荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI-EGFP和p△GP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白，转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白，而转染有辅助载体p△GP的HIC细胞不表达绿色荧光。结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功，表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性，并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子。     

HaNPV穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达

ＨａＮＰＶ穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达＊朱应齐义鹏＊＊刘德立（武汉大学病毒研究所，武汉４３００７２）关键词棉铃虫核型多角体病毒，穿梭载体，绿色荧光蛋白基因分类号Ｑ７８，Ｓ８５２．６５杆状病毒表达载体被广泛用于表达各种外源基因．由于...     

表达猪瘟病毒E2基因和gfp报道基因的伪狂犬病病毒双基因转移载体的构建

将以PRVgG为启动子，SV40plyA为加尾信号的CSFV E2表达盒克隆于包含伪狂犬病病毒（PRV）tk基因和gH基因片段的重组质粒pTK2.5,替换掉tk基因的SalⅠ与XhoⅠ酶切位点之间的序列，构建了携带CSF E2基因的转移载体pTKE2。免疫荧光检测证实，转染BHK21细胞pTKE2在感染PRV的情况下，能表达E2蛋白，采用特异性引物PCR方法扩增gfp表达盒，对酶切位点进行改造，将其克隆到pTKE2的SalⅠ位点，构建了利用PRV gG启动子和HCMV IE启动子分别控制E2基因和gfp基因表达，两基因取向相反的双基因转移载体pTKE2.EFP.将双基因转移载体pTKE2.GFP转染BHK21细胞中，12h后在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的GFP表达，表达的GFP不引起细胞毒性。     

猪瘟病毒RT-PCR产物的T载体克隆、测序及同源比较

利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶的无模板延伸活性制备了可直接克隆ＰＣＲ产物的Ｔ载体，并成功地对猪瘟病毒ＨＣＬＶ株的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行了克隆．ＤＮＡ序列测定和同源性分析表明该ＲＴ－ＰＣＲ产物是猪瘟病毒特异的，与已知序列的猪瘟病毒毒株的序列同源性均高达９６．７％～９８．７％．ＨＣＬＶ株与Ｃ株具有相同的起源，但序列比较发现它们既有共同的点突变，也有序列上的差异，表明这两株病毒在各自独立的传代过程中已发生了各不相同的遗传性变异，值得进一步比较研究．     

小鼠单抗R5基因的克隆和基于CDR相似性的人源化质粒构建

抽提小鼠R5杂交瘤细胞的mRNA,逆转录成cDNA,扩增出R5单抗的轻重链基因．分析克隆到的轻重链基因的序列信息,得到互补决定区（cDR）序列信息．构建真核表达质粒并在真核细胞中表达．采用互补决定区移植（CDR-grafting）的方法人源化鼠源单抗R5基因．先从人种系（germline）抗体基因片段中选出和克隆到的小鼠R5抗体基因具有相同互补决定区正则结构类型（CDR canonical structure class）的片段,合成寡核苷酸并采用PCR重叠延伸（overlap extension）的方法得到人源化的VL和VH,并采用双酶切方法分别克隆入昆虫杆状病毒表达载体pAc-k-CH3中,经测序确定序列正确．大抽后的质粒和线性杆状病毒DNA共转Sf9昆虫细胞,表达得到的抗体用ELISA能检测到和抗原的结合活性．轻重链基因的成功克隆和人源化表达质粒的构建及表达为下一步改善人源化R5单抗的特性打下了基础,并向R5单抗的抗肿瘤临床应用迈进了一步,具有重要的意义．     

北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒pΔGP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失突变gag和pol基因,并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR,构建辅助质粒pΔGP.将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP和辅助质粒pΔGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系,荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI EGFP和pΔGP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白,转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白,而转染有辅助载体pΔGP的HIC细胞不表达绿色荧光.结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功,表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性,并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子.     

人巨细胞病毒UL131A,UL130,UL128基因在先天感染患儿临床株中的变异

对18株临床低传代分离株和5株未传代的人巨细胞病毒（HCMV）临床标本分别进行HCMV UL131A，UL130，UL128基因全序列PCR扩增，并进行序列测定及分析．对23株HCMV临床株的UL131A，UL130，UL128基因编码区域进行比较，结果显示此3个基因核苷酸及其编码蛋白是高度保守的，3个基因的核苷酸同源性为96．2％，95．8％，96.0％，编码蛋白的同源性为97．2％，96．6％，96．9％．不同临床症状患儿的HCMV UL131A，UL130，UL128基因及其编码蛋白具有相似的结构．临床株HCMV UL130和UL128基因编码蛋白具有趋化因子的相似结构．所有结果表明临床株中的UL131A，UL130，UL128序列的保守性可能与HCMV在上皮细胞的增殖有关，也与HCMV转移到白细胞和树突状细胞相关．HCMV UL130和UL128基因编码蛋白具有趋化因子的相似结构可能与HCMV的感染相关．     

鸭源H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆、序列分析及原核表达

参照GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计并合成引物,以鸭源H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,利用RT PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18 T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子.测序结果表明HA基因长为1683bp.基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX KG中,与GST融合表达.SDS PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量约为90×103.Western印迹表明表达蛋白具有免疫活性.     

呼吸道合胞病毒感染SPC-A1相关新基因zlg10con的电子克隆及分析和验证

通过mRNA差异显示法获得了与呼吸道合胞病毒感染SPC-A1细胞相关的52个表达序列标签(EST)片段，其中的一个EST片段g10-1在RSV感染后的细胞中高表达．采用生物信息学原理和方法对g10-1进行了鉴定后预测这是一个新基因片段，经电子克隆获得了761bp的延伸产物，并且通过了实验验证．该基因片段含有一个典型的54个氨基酸的ORF，命名为zlg10con，并对该序列进行了蛋白结构和功能的分析．     

AES的轻量优化及其在射频识别标签中的应用

由于射频识别标签本身具有资源受限的特点,因此它只能采用轻量级的加密算法.AES(advancedencryption standard)是当今世界著名的加密标准算法,它具有安全、适应领域宽、实现方便等特点.为了能够把AES用于射频识别标签系统,必须对其进行轻量化处理.本文在对AES加密过程分析的基础上进行了优化设计,采用模块复合结构提高利用率.经仿真实验证明,本文提出的方案符合射频识别标签系统集成电路面积小和低功耗的要求,同等条件下加密速度较快,且如标签同时实现加解密功能,芯片面积及响应时间等综合指标将达到最优化.这一方案同样适用于传感器网络以及其他资源受限环境中.