地衣芽孢杆菌A.4041耐高温α-淀粉酶的纯化及性质

地衣芽孢杆菌A.4041（Bacillus，licheniformisA．4041）耐高温α-淀粉酶，经硫铁沉淀和垂直板制备凝胶电泳纯化，得到三种电泳均一的组分，α－Ⅰ，α－Ⅱ和α－Ⅲ．其相对质量分数分别为14.7％，32.2％和52.9％；等电点为5．2，5．4和5．5；相对分子质量为48000，55000和60000．酶作用于可溶性淀粉的米氏常数分别为4.5mg／mL，3．4mg／mL和2．6mg／mL．最适作用温度皆为90℃；最适pH为6.0～6.5；稳定pH范围皆为4～11．5在温度高于70℃，保温30min条件下，三组分的活力开始下降，但α－Ⅱ和α－Ⅲ在100℃，保温30min时仍分别保持15％和20％的残余活力，表明该酶的热稳定性良好．Ca2+，Mg2+，K+对酶明显激活；Cu2+，Fe3+，Zn2+，Al3+，EDTA、甲醛、戊二醛对酶强烈抑制．     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因工程菌的研究进展

综述了国内外地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因工程菌的研究进展，并就基因工程菌的优缺点进行了简要分析．     

地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及原核表达

地衣芽孢杆菌(Bacillus Lichenifarmis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶(α-amylase)的优良菌株．本实验在提取地衣芽孢杆菌完整的基因组DNA序列的基础上，通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的结构基因全长1449bp，与pUCm-T载体连接转化入宿主菌DH5α中，经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌，再提取质粒与表达载体pET-28a( )酶切后连接转化入宿主菌DE3中，其阳性克隆在37℃1．0mmol/L IPTG诱导下，α-淀粉酶的基因得到了较好的表达．表达产物经SDS—PAGE鉴定，确定表达的蛋白大小为58000 Dal左右，与理论推导的分子量相一致；并初步对酶及活性及酶活最适温度和pH进行了研究。     

重组耐高温α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

基因工程菌所产生的重组耐高温α-淀粉酶,通过超滤浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化,得到电泳纯的耐高温α-淀粉酶.并测得该酶的分子量为63 KD,等电点pI(室温)为5.5,最适pH为6.0~6.5,稳定pH范围为4~11.5.耐高温α-淀粉酶的最适作用温度为90℃,95℃以上活力下降明显,100℃保温30 min仍保留22%的酶活力;金属离子Cu2 、Fe2 、Fe3 、Zn2 及金属鏊合剂EDTA和柠檬酸盐离子对酶活有显著抑制作用,Mn2 、Mg2 有微弱的抑制作用,K 、Ca2 和表面活性剂SDS有微弱的激活作用,而其他一些离子如Na 、Li 则对酶活影响不大.     

藻红蓝蛋白裂合酶F亚基中色氨酸残基的化学修饰

以N-溴代琥珀酰亚胺作为修饰剂,对藻红蓝蛋白裂合异构酶F亚基中的色氨酸(Trp)残基与酶活性的关系进行了研究.研究表明, PecF的Trp残基均位于分子内部,NBS的修饰导致了酶活性的显著降低,但并未完全失去活性.酶被修饰后的荧光和圆二色谱均发生了变化,为酶的结构和功能间关系研究提供了重要信息.     

补料分批发酵提高耐高温α-淀粉酶发酵活力的研究

对耐高温α-淀粉酶分批发酵与补料分批发酵工艺进行了研究,结果表明,在35t发酵罐生产条件下,初糖淀粉质量浓度为200g/L,当发酵液中还原糖DE值降至25mg/mL以下时,开始3～5L/min流速流加复合营养盐培养基,使发酵液中DE值维持在20～25mg/mL水平,控制总糖质量浓度为245g/L,在最佳补料分批发酵工艺条件下,放罐酶活力为15600U/mL,较分批发酵的9649U/mL提高61.7%,同时每标吨酶耗淀粉量可降低20%.     

响应面法优化Anoxybacillus sp.YIM 342产耐高温α-淀粉酶发酵条件

 利用响应面法对Anoxybacillus sp.YIM 342产耐高温α-淀粉酶的液体发酵培养条件进行优化.在单因素试验的基础上,首先应用Plackett-Burman实验设计筛选在发酵过程中对产酶量影响较大的因素,然后利用中心组合设计确定对产酶量影响较大因素的最佳水平.筛选结果表明,淀粉和CaCl₂ 的浓度以及发酵时间对产酶量有显著的影响;最佳发酵条件为:淀粉11.73 g/L,CaCl₂ 0.65 g/L,发酵时间为37.27 h,胰蛋白胨5 g/L,MgSO₄ 0.5 g/L,起始pH值6.5,转速200 r/min,温度55℃,在此条件下产酶量达到了62.71 U/mL,较初始产酶量提高了3.25倍.     

嵌合信号肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

为提高α-淀粉酶的分泌效率,将不同天然信号肽的N,H和C区进行组合,以期筛选出优于天然信号肽的嵌合信号肽。首先从天然信号肽库中筛选了适合解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中分泌的天然信号肽,以其中4种天然信号肽（SPyvcE,SPyoqM,SPBglS和SPyobB）的H区替换信号肽SPsacB的H区,构建4种嵌合信号肽RSP1—RSP4指导α-淀粉酶的基因工程菌株。结果表明,适合α-淀粉酶的最适天然信号肽和嵌合信号肽分别为SPyoqM和RSP1,且RSP1指导α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌的分泌效率较SPyoqM提高27%,较具有相同H区的SPyvcE提高了3.6倍,较仅H区不同的SPsacB提高了2.07倍。嵌合信号肽构建策略是一种有效提高α-淀粉酶分泌效率的方法,可为其他蛋白质的高效分泌提供参考。     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

α-淀粉酶的超滤研究

对用超滤法浓缩分离α-淀粉酶过程进行了研究,讨论了料液浓度、膜面液体流速、操作压力等因素对超滤过程的影响。实验结果表明,用醋酸纤维素超滤浓缩α-淀粉酶的过程可用扩散模型来描述,超滤时宜控制压力在0.3～0.4MPa范围内。用超滤法能有效地浓缩α-淀粉酶,酶的总回收率大于90％。此外,通过实验建立了分离过程的传质模型,为超滤法浓缩α-淀粉酶的工业设计提供了依据。     

枯草杆菌α-淀粉酶的活性研究

研究了酸度、温度、钙离子对枯草杆菌α－淀粉酶活性的影响。研究表明，ｐＨ值对酶活影响较大，最适作用温度随底物种类及其浓度而异。研究确立了酶一步失活模型，指出在较高温度和长时间作用的条件下，应有钙离子的保护，以发挥α－淀粉酶的效能     

α-淀粉酶的研究与应用

介绍了α-淀粉酶的分离纯化和活力测定方法,耐高温α-淀粉酶和耐酸性α-淀粉酶的研究状况及α-淀粉酶在食品和医药工业中的应用,并指出α-淀粉酶具有很大的经济、社会和环境效益。     

乙腈对α-淀粉酶催化活性的影响

乙腈对α-淀粉酶活性具有抑制作用,这种抑制作用随着乙腈溶液浓度的增大而增强。动力学分析表明乙腈的抑制类型为线性混合型抑制作用。紫外吸收光谱和荧光发射光谱分析显示酶的二级结构在乙腈作用下发生了变化,导致了酶活性的丧失。     

α-淀粉酶固态发酵的研究

研究了固态法发酵生产α－淀粉酶的工艺,用麸皮作原料,其优化条件是:在接种量0.08%,拌水比1：0.6,pH6.0,培养温度37℃,葡萄糖浓度15%,发酵72小时,其酶活力可达1742u/g。与液态发酵相比,固态发酵能有效地克服分解代谢产物的阻遏作用。     

枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究

以枯草杆菌（BacillussubtilisBF7658）为实验菌株,以淀粉为主要原料,采用液态培养基摇瓶发酵,生产α-淀粉酶。结果表明：①在23℃至44℃内,培养基起始PH为自然PH,产酶最适培养温度为：37℃②枯草杆菌在淀粉液态培养基中37℃,振荡培养,其产酶最适淀粉水组成为：淀粉：水=75：100;③在最适温度37℃下,淀粉：水=75：100时,最适培养时间为36h。     

地衣芽胞杆菌麦芽糖α-淀粉酶产麦芽糖特性研究

为了开发新的生产麦芽糖浆的淀粉酶,在大肠杆菌中表达了一个地衣芽胞杆菌(Bacillus lichen form is)麦芽糖α-淀粉酶,并对该酶产麦芽糖的特性进行研究.结果显示,重组酶分子大小为65 kDa,以淀粉为底物的最适温度为45℃,最适pH值为6.5.以浓度为20％的可溶性淀粉为底物,加入106U/g淀粉的地衣芽胞杆菌麦芽糖α-淀粉酶,反应48h,采用HPLC检测产物,产物中只有葡萄糖和麦芽糖,其中麦芽糖含量为52.21％,还原糖得率为72.1％;当加入1U/g淀粉的普鲁兰酶协同作用进行反应时,产物中麦芽糖的含量增加到57.16％,还原糖得率增加到92.5％.该酶在麦芽糖浆的工业生产上有较大的潜在应用价值.     

α-淀粉酶发酵条件的优化

利用米曲霉菌株液体发酵生产α-淀粉酶。产酶培养基优化试验表明：以面粉为碳源,黄豆饼粉为有机氮源,NaNO3为无机氮源。发酵配方如下（g/L）：面粉浓度为45,黄豆饼粉浓度为20,NaNO3 4,K2HPO4 3,MgSO4 1,FeSO4·7H20 0.01。产酶培养条件优化表明：最适发酵初始pH为7,装液量为40mL（250mL三角瓶）,接种量为10%,发酵温度为33.5℃,摇床转速为235rpm,培养时间为72h。此条件下,最终发酵水平达到1962.32U/mL,比初始时提高45%。     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达栽体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770 U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8 U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AM...     

α-巯基噻唑啉的合成改进

以硫酸、乙醇胺和二硫化碳为主要原料,经酯化,成环,合成2-巯基二氢噻唑啉.探讨了混合温度、物料比、反应温度等对反应收率的影响.得出的最佳工艺条件为:20 ℃时,将乙醇胺和硫酸以 1:1.2 的摩尔比混合,在45～145 ℃范围内减压蒸馏得2-氨基乙基硫酸酯,再与二硫化碳在碱性条件下反应生成α-巯基噻唑啉.产物收率均达到90%以上,较国内平均水平提高了20%以上.产物结构用1HNMR和MS进行表征确证.合成过程操作简单,原料易得,条件温和,成本低,产率高.     

α-淀粉酶的化学发光行为研究

利用α－ 淀粉酶水溶液直接催化Ｌｕｍｉｎｏｌ－ Ｈ２ Ｏ２ 的化学发光反应, 结合流动注射技术, 对α－ 淀粉酶的化学发光行为进行了探讨． 该反应属于快速的双电子氧化的一级反应, 从进样开始到出现最大发光值约需１０ｓ, ６０ｓ 后, 发光强度趋于零． 对不同温度的α－ 淀粉酶的扫描电镜图谱及热分析图谱考证了温度与α－ 淀粉酶的化学发光行为的关系．