盐藻磷酸甘油脱氢酶基因cDNA文库的构建

采用Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０载体构建了盐藻ｃＤＮＡ文库，文库大小为１０＾６／ｍＬ插入片段平均长度大于１ｋｂ。根据果蝇，兔，鼠编码其３－磷酸甘油脱氢酶基因的辅酶ＮＡＤ的结合功能区保守序列设计一对引物，大小分别为２１ｂｐ和１８ｂｐ。ＰＣＲ扩增得到与果蝇相同的２９０ｂｐ特异扩增片段，以该片段为探针，采用缺口平移系统标记原位杂交，从盐藻ｃＤＮＡ文库中获得３６个３－磷酸甘油脱氢酶基因的阳性克隆。     

杜氏盐藻渗透压调节与三磷酸甘油脱氢酶同功酶的电泳分析

报道了盐藻在ＮａＣｌ浓度为０．１－３．５ｍｏｌ／Ｌ的培养液中均能够正常生长，其最适生长盐浓度为０．１－１．５ｍｏｌ／Ｌ，并能随大幅度的高渗震动。用超声波破壁后得到的细胞抽提液，经７．５％聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离出３个三磷酸甘油脱氢酶的同功酶组分。其中“调渗型”同功酶被证明与渗透压调节紧密相关，同时还发现在“调渗型”同功酶附近，有４条着色较浅的同功酶带，其变化情况与“调渗型”同功酶相似。     

不同胁迫下盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因表达及其与甘油合成的响应

在已克隆的盐藻（Dunaliella salina）3-磷酸甘油脱氢酶GPD基因的基础上,利用实时荧光定量PCR的方法,研究了经高盐、厌氧、磷酸盐以及氧化等不同外界胁迫条件下该基因的表达情况,并同时监测了盐藻细胞甘油合成的动态变化.对比酿酒酵母的GPD基因,发现D.salina GPD基因受高渗诱导,同时D.salina细胞内可能存在多个形式的GPD基因.     

盐生杜氏藻和衣藻双结构域NAD+-GPD基因的生物信息学分析

盐生杜氏藻（Dunaliella salina）是极端耐盐的单细胞真核绿藻,依赖于NAD的3－磷酸甘油脱氢酶（NAD+-GPD）是盐生杜氏藻调渗物质——甘油合成的关键酶.盐生杜氏藻NAD+-GPD基因是第一个被发现含双结构域（SerB和GPD）的GPD基因.而双结构域可能是盐生杜氏藻具有极强耐盐性和快速合成甘油的关键.通过与莱茵衣藻基因组数据库比对,发现莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中也存在具有SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因序列.在对两个物种NAD+-GPD基因的基因结构、mRNA组成成分、编码蛋白及其理化性质和编码蛋白结构的分析中,发现二者具有较高的相似性.针对目前仅在盐藻和衣藻中发现含SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因这一现象,分别对SerB和GPD结构域同源基因的系统进化进行了分析.     

盐藻尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(DsUGD)基因的功能预测

盐生杜氏藻（Dunaliella salina）具有极强的耐盐性,藻体含有大量的胡萝卜素、蛋白质以及多糖类化合物．目前,已有研究报道指出蓝藻多糖是其适应高盐、高碱等环境的重要因素;而盐藻多糖的作用尚未见相关研究．尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDP-glucose dehydrogenase,UGD,EC1．1．1．22）是多糖合成中的一个关键酶,它催化产生的UDP-葡萄糖醛酸是多糖合成中的关键前体物质．在微生物中,该酶参与到荚膜多糖的合成,是其致病性原因所在;在高等植物中,UGD参与到半纤维素的合成,与植物细胞壁形成密切相关．盐生杜氏藻是一类低等光合植物,它没有细胞壁和荚膜,因此关于UGD在该物种中的作用有待进一步研究．     

盐胁迫下盐藻特异表达基因片段的克隆

盐碱、干旱、极端温度等逆境条件是影响植物生长的重要因素。以抑制消减杂交及差式库的筛选对盐藻（Dunaliella salina)在高渗胁迫下特异表达基因片段进行了克隆。比较长期（1周,LS）及短期（16h,SS)NaCl胁近条件下基因表达情况,前者克隆到2个特异表达片段,后者也有2个。通过测序及Gene Bank中进行同源搜索,均未有可靠的同源性结果。可以初步认为,以上得到的4个cDNA可能是新基因或此片段不在保守区内。     

NaCl诱导表达的盐藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因克隆及原核表达

通过RACE技术克隆到盐藻（Dunaliella salina Teod.)果糖－1，6－二磷酸醛缩酶（DsALDP)的全长cDNA,对其序列分析及在GeneBank中进行同源搜索，发现DsALDP基因属于果糖－1，6－二磷酸醛酶基因家族，其与植物叶绿体果糖－1，6－二磷酸酯缩酶（AldP)基因的一致性为73％－66％。Northern杂交结果及醛缩酶活性分析均表明它角为在盐诱导下特异表达。将DsALDP cDNA构建到pET32a载体上，转入E.coli BL21进行表达分析。IPTG诱导后可以检测到－62ku基因产物大量表达。经不同浓度NaCl处理，表达DsALDP基因产物的细菌耐盐性明显高于对照组。     

盐藻rbcS基因克隆及其原核表达

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Ribulose1,5-bisphosphate carboxylase／oxygenase,E,C．4,1．1．39简称RuBisCO）是光合作用中的关键酶,作者应用RT-PCR技术从一种极其耐盐的生物-杜氏盐藻的总RNA中克隆RuBisCO的小亚基（rbcS）的cDNA,它的开放读码框为570bp,编码190个氨基酸,将此cDNA定向克隆于原核表达载体pET-30a（＋）中,构建重组质粒pET-rbcS,经IPTG诱导,在大肠杆菌株BL21中表达．SDS-PAGE电泳表明,rbcS融合蛋白分子量约为26kDa．     

盐藻的耐盐机理的研究

盐藻一直以来都被作为研究植物耐盐的模式物种，对其的研究已有一百多年的历史，积累了大量的数据．本文综述了对盐藻耐盐的主要研究文献，包括盐藻分类，生理生化特征和分子生物学三个方面，递进式的阐述了盐藻的研究现状，并着重介绍了盐藻耐盐的分子生物学的相关研究，并提出盐藻耐盐的未来研究方向．     

盐藻的耐盐机理的研究

盐藻一直以来都被作为研究植物耐盐的模式物种,对其的研究已有一百多年的历史。积累了大量的数据．本文综述了对盐藻耐盐的主要研究文献,包括盐藻分类,生理生化特征和分子生物学三个方面,递进式的阐述了盐藻的研究现状,并着重介绍了盐藻耐盐的分子生物学的相关研究,并提出盐藻耐盐的未来研究方向．     

盐生杜氏藻的完整叶绿体分离

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是世界上最耐盐的一种单细胞真核绿藻,可在含0．1～5．0mol／L NaCl的培养液中正常生长．盐生杜氏藻细胞内的主要调渗物质是甘油,在甘油代谢途径中,3-磷酸甘油脱氢酶是一个关键酶．近年来的研究表明杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)细胞质和叶绿体中都存在3-磷酸甘油脱氢酶的同工酶,且叶绿体上的同工酶与渗透调节作用直接相关,为了解D．satina中3-磷酸甘油脱氢酶同工酶的细胞定位和分布,我们通过冰浴超声波破碎和蔗糖密度梯度离心,获得盐生杜氏藻的完整叶绿体,用相差显微镜镜检、酶的活性分析等方法对其完整性作了初步分析。     

重组盐藻14-3-3蛋白基因的原核表达及分离纯化

根据克隆的杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因.经原核表达、Ni2+亲和层析法纯化,免疫动物制备抗体. 抗体蛋白质印迹分析检测结果表明抗体能特异结合盐藻细胞分子量为29 kD的多肽.     

黑曲霉(Aspergillus niger)三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GPD)的序列测定与同源性分析

ｐＡＮＧＰＤ是用构巢曲霉ＧＰＤ基因片段为探针,从黑曲霉基因组文库中筛选到的一个三磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＧＰＤ）阳性克隆．作者对该阳性克隆进行了亚克隆和序列测定,结果表明,基因片段总长２４４１个核苷酸（ｎ．ｔ）,其中５’－端非编码区长９８１ｎ．ｔ,编码区（从起始密码子ＡＴＧ到终止密码子ＴＡＧ）长１４４６ｎ．ｔ,３’－端非编码区长２４ｎ．ｔ,基因启动子区含有ｇｐｄ－盒和ＣＴ－盒序列,但无明显的ＣＡＡＴ盒和ＴＡＴＡ盒序列．ＧＰＤ基因由７个外显子和７个内含子构成,外显子全长１００８ｎ．ｔ,编码的蛋白质长３３６个氨基酸残基．通过序列比较分析,发现该基因与构巢曲霉的ＧＰＤ基因有许多相似之处;它们的基因启动子序列都含有ｇｐｄ－盒和ＣＴ－盒,其同源性分别为９６％和６５％;推测的两个ＧＰＤ蛋白的氨基酸同源性高达９０％;两个基因所含内含子数目及位置相同．     

青岛文昌鱼NADH脱氢酶亚基I基因片段的克隆

NADH脱氢酶亚基I是细胞电子传递链的主要成员之一，采用简并引物PCR方法获得青岛文昌鱼NADH脱氢酶亚基I基因片段，将基氨基酸序列与其他生物如佛罗里达文昌鱼，斑马鱼，爪蟾等无脊椎和脊椎动物NADH脱氢酶亚基I基因相应片段进行了同源性分析，均显示较高的同源性，研究结果证实青岛文昌鱼作为脊索动物的代表之一，与脊椎动物有着较近的亲缘关系，是从无脊椎动物到脊椎动物的过渡类型。     

尿素对难溶性磷酸盐作用的分析

通过试验得知尿素与磷肥混和施用，土壤中水溶性磷的含量比单施磷肥时要高，表明尿素有活化难溶性磷酸盐的作用．     

葡萄糖对磷酸盐生理溶液电还原反应的影响

报道了在负电位区葡萄糖的电还原的两个很好氧化还原峰［Ｅ＿（ｐｃ）＝－０．７１５Ｖ和Ｅ＿（ｐａ）＝－０．６１５Ｖ．对于Ａｇ／ＡｇＣｌ电极，在３７℃］，其葡萄糖在磷酸盐生理溶液中的浓度与还原峰电流密度呈线性。详细地讨论了这一电化学反应的机理。