北京鸭肝脏线粒体DNA的限制酶图谱

本文用五种限制性内切酶(EcoRⅠ,BamHⅠ,PstⅠ,BglⅠ和BglⅡ)建立了北京鸭肝脏线粒体DNA的内切酶图谱。这五种酶除BglⅡ不能切割鸭肝线粒体DNA外,EcoRⅠ,BamHⅠ,PstⅠ和BglⅠ在鸭肝线粒体DNA上分别有1,2,4和5个切割位点。应用电子显微镜及电泳法对鸭肝线粒体DNA的各种酶解片段进行测定后,推导出了此线粒体DNA的限制酶图谱。此外,还确定了D-环的位置及线粒体DNA复制的方向。     

家蚕核多角体病毒基因库

本文报道家蚕核多角体病毒基因组DNA经限制性内切酶SalI酶解,琼脂糖凝胶电泳分离,得0.70至 10.0kb大小不同的29种片段.所得 DNA片段与 SalI酶解之质粒pBR 322 DNA进行体外重组后,经转化大肠杆菌 HB 101菌株,获得带重组质粒克隆株.根据重组质粒DNA 中SalI酶插八片段的分子量、Southern法DNA杂交及多种限制性内切酶酶切点等方法鉴定,证明已将家蚕核多角体病毒DNA的24种不同大小的片段克隆在质粒 pBR 322 中.克隆的 DNA片段总长度占病毒基因组DNA的百分之八十。     

创新霉素产生菌中质粒的研究——AJP1质粒在大肠杆菌中的分子克隆

放线茵质粒AJP1 和大肠杆菌质粒pHE3利用Xbal位点作体外重组.本文报道杂合质粒pAx的建造及其分子量测定、酶切性质鉴定、电子显微镜观察、对大肠杆菌C_(600)的转化活性以及在大肠杆菌中抗菌素抗性表达的鉴定。     

重组人OCIF结构域D1～D6基因在毕赤酵母中的表达

利用PCR以实验室构建的原核重组表达质粒pProEX-OCIF为模板扩增得到N末端融合有6×His标签和rTEV蛋白酶识别序列的人破骨细胞形成抑制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryFactor,简称OCIF)结构域D1～D6(简称O CIFm)编码基因片段;将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌TOP10,筛选得到阳性重组质粒pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIFm基因片段;将其定向插入甲醇营养型酵母分泌表达载体pPIC9中,构建获得重组表达质粒pPIC9-OCIFm.测序验证后,以限制性内切酶SalⅠ线化,电穿孔转化酵母宿主菌GS115.筛选得到阳性表达菌株后,甲醇诱导表达4d,SDS-PAGE和Westernblot对表达情况进行分析和确认.所获得的OCIFm基因片段在甲醇营养型酵母中表达量占菌体总蛋白的30%以上.利用Ni-NTA树脂对表达产物进行一步亲和层析纯化.活性测定表明纯化的表达产物可诱导体外培养的成熟破骨细胞样细胞的凋亡.表达产物的生物学活性较利用原核表达系统明显提高.     

Azorhizobium caulinodans ORS571结瘤位点5(nod locus 5)的鉴定

用克隆的含A.caulinodans ORS 571 nodABC基因启动子区域(P_1)的800bp AccⅠ-pUC Ⅱ DNA做探针,在染色体上探测到另一个与P_1同源的8.4kb DNA片段,从ORS571 pLAFR1基因文库中分离到带有该片段的克隆子pRG90,8.4 kb DNA的内切酶图谱分析及DNADNA杂交实验表明同源区(P_2)位于450bp SmaⅠ-SphⅠ片段内。用Ω因子对8.4 kb DNA进行缺失插入突变,鉴定出一个使S.rostrata结瘤延迟的突变株ORS571-5。该突变株结瘤延迟的表型可由pRK84质粒(nod locus 5)互补。     

中国人苯丙氨酸羟化酶基因的限制酶位点多态性研究

本文应用人类苯丙氨酸羟化酶(PAH)cDNA作杂交探针,分析了80例中国正常人和28例苯丙酮尿症(PKU)患者PAH基因的八个限制性内切酶多态性位点:Bgl Ⅱ 3.6kb/1.7kb,EcoRI 17kb/11kb,EcoRV 30kb/25kb,Hind Ⅲ 4.2kb/4.0kb,Msp Ⅰa 23kb/19kb,Msp Ⅰb 4.0kb/2.2kb,Pvu Ⅱa 19kb/6.0kb和Pvu Ⅱb 11.5kb/9.1kb。测得中国人正常PAH基因的上述限制酶位点多态性(RFLP)的发生频率分別为0.13,0.83,0.77,0.81,0,12,0,04,0.70和0.10;而缺陷PAH基因的上述RFLP发生频率分别为0.12,0.93,0.89,0.81,0.04,0,0.69和0.04。这表明中国人的PAH基因限制酶位点多态性和白种人的有较大差异。可以通过PAH基因的RFLP检查进行中国人PKU的产前诊断。     

人乙型肝炎病毒——HBVadr亚型基因组的克隆和限制酶切图谱

以pBR322为运载体将HBV adr亚型基因组Bam HI酶切的3.2Kb片段克隆入E.coli.Bam HI,HindⅢ,BglⅠ,BglⅡ,AvaⅠ,HincⅡ,SphⅠ,XbaⅠ,XhoⅠ,SstⅡ等10种限制酶的16个切点已被定位。制作了HBV adr亚型基因组的限制酶图谱。Eco RⅠ,PstⅠ,SmaⅠ,HpaⅠ,KpnⅠ,PvuⅡ,SstⅠ等没有切点,与已报道的adw,ayw,adyw亚型基因组的限制酶图谱明显不同。     

聚合酶链反应用于高效的基因改造

本文报道利用近年来发展起来的基因体外扩增技术——聚合酶链反应(PCR)进行高效的基因定向改造的结果。在构建新的EcoRI基因表达质粒时,为了在EcoRⅠ基因SD序列前改变一个碱基引入SalⅠ切点以缺失其启动子,同时将Glul44改造成Lys,我们回收分离pER101的1.5kb SalⅠ/PatⅠ片段作为模板,合成各带一个错配的两个25聚DNA片段作为扩增引物,利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增,结果经过30个循环,从约0.05μg模板DNA得到约10μg的0.49kbDNA。根据理论计算,扩增产物中突变片段占99％以上。用SalⅠ/BglⅠ酶切克隆入pUCl9 SalⅡ/BamHI,任意取两个重组子进行序列分析结果表明都发生了预期的突变。扩增产物已被克隆入pER304,使得EcoRl(Lys-144)基因置于PL下游以实现其控制的高表达。     

具有生物活性的人带3蛋白胞质片段融合蛋白的克隆、表达与纯化

用PCR法从质粒pHB3中扩增了人红细胞带3蛋白胞质片段(CDB3)基因.PCR产物经限制性内切酶切割后与多克隆位点处带有编码6个组氨酸序列的高效表达载体pET28b连接,构建为重组子pCDBHistag.重组子经酶切及序列测定后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,可溶性目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右.C端带有6个连续组氨酸的带3蛋白胞质片段作为融合蛋白不仅可以降低宿主菌蛋白酶对其水解程度,而且简化了目的蛋白的纯化过程.经一步螯合Ni²⁺的亲和层析获得了电泳纯的带3蛋白胞质片段融合蛋白.活性测定结果表明,带3蛋白胞质片段融合蛋白能够抑制醛缩酶(Aldolase)活性的70%,与文献报道的人红细胞内带3蛋白胞质片段具有相同的功能.     

豌豆根瘤菌中Tn5转座抑制的研究

由抗性质粒R1033的BamHI片段置换原型Tn5的BglⅡ中心区段后改变了原有的抗性标记。由此重组转座子Tn5-GmSp构建两种类型的自杀质粒(pXS102和pCW3/pCW30)用于Tn5-GraSp的转座。在一些预先标有原型Tn5的根瘤菌株里,这两种类型的Tn5-GmSp转座频率均受到抑制。其中,用pXS102作诱变因子,分离后代中大多数滞留有缺失的载体质粒pXS102。但在pCW3/pCW30的转座诱变中,具有抗性标记的载体质粒不能独立存在于分离子中,而是通过基因重组的方式整合到根瘤菌的基因组内并随之复制。     

家蚕核多角体病毒的多角体蛋白基因

本文用AcMNPV多角体蛋白质基因的克隆DNA作探针,从BmS NPV DNASal Ⅰ酶酶解片段基因库中筛选出一个有同源顺序的克隆pBN 61。该克隆含大小为1.65 kb插入DNA片段。本文报道了该片段的Hind Ⅲ,Hpa Ⅱ和Alu Ⅰ等限制性内切核酸酶酶切图谱分析和部分DNA顺序分析结果。测得的DNA顺序中有138个碱基与已报道的BmSNPV多角体蛋白质一级结构中的46个氨基酸顺序相比较,除一个氨基酸发生变化外,其余完全相一致。克隆pBN 61可能包含完整的Bm SNPV多角体蛋白质结构基因。     

人原发性肝癌及7402细胞株和髓细胞白血病细胞株(K562)的癌基因(转化基因)的共同属性——N-ras基因

用人的原发性肝癌(PHC)、肝癌7402细胞株(郭婵等,1984)及髓细胞白血病K562细胞株的DNA转染的NIH/3T3转化株DNA,以Southern吸印和~(32)P-标记的癌基因探针做分子杂交来分析,结果如下:在PHC DNA转化的NIH/3T3细胞DNA中,鉴定有N-ras基因的7.2及9.0kb(EcoRI酶切)的带,与人白细胞和肝癌DNA中出现的专一性条带相同,但是没有人Ha-ras(BamHI 6.6kb)或Ki-ras(EcoRI 3.0kb)的专一性条带。在以7402及K562细胞株DNA转化的细胞DNA中,同时发现有人的N-ras和Ha-ras基因(6.6kb,BamHI酶切),人的Ki-ras特异片段(3.0kb,EcoRI酶切)没有被检测到。PHC的DNA中N-ras基因在带型及杂交强度上没有大的改变,由于N-ras基因(非Ki-ras,Ha-ras)的表达,在多数PHC中明显地增加,提示了N-ras至少是人肝癌的转化基因之一。     

中国人促红细胞生成素基因组的克隆及其在COS-7细胞中的表达

本文利用PCR技术,从正常人胎肝染色体DNA库中分离克隆了长度分别为506bp,465bp的中国人促红细胞生成素(EPO)基因组片段。506bp基因片段包括外显子2(信号肽),内含子2和外显子3;465bp片段包括外显子4,内含子4和外显子5。通过在引物中设置的酶切位点将两个克隆片段进行了正确的拼接,从而得到了约1.0kb的EPO次全基因组片段,它包括除信号肽中第2,3,4位氨基酸外的所有编码区及两个内含子序列。 所克隆的次全EPO基因组插入表达载体pSV2-dhfr中的不同克隆位点,构建了3种不同的转移载体质粒,分别转染导入COS-7细胞后,3种转移载体质粒转染的细胞上清液都有明显的EPO活性。本工作证明仅含有内含子2,4序列,去除负调控区和氧敏感区序列的人次全EPO基因组可以在COS-7细胞中获得表达。     

具有原核基因启动子活性的家蚕核多角体病毒的DNA片段

本文利用大肠杆菌启动子克隆用质粒pHE5,克隆和分离了家蚕核多角体病毒基因组的8种HindⅢ酶解DNA片段和一种SalⅠ酶解DNA片段。我们发现它们都具有指导抗四环素基因表达的启动子活性。测定了含有这些DNA片段的重组质粒的菌株抗四环素能力。其中最高的可以抗四环素至每毫升约30μg。我们分析了一个DNA片段的部分核苷酸顺序。发现它具有与原核基因启动子极相似的顺序结构。     

新多环特特拉姆酸大环内酰胺3-Hydroxycombamide Ⅰ的发现

从链霉菌S001的重组菌株S001-cbm-OX4-ikaD中分离获得1个新多环特特拉姆酸大环内酰胺(Po TeMs)类化合物3-hydroxycombamide Ⅰ (2),通过一维、二维核磁共振波谱(NMR)和高分辨质谱(HRMS)数据分析确定其化学结构.化合物2的C-3位羟基推测为宿主链霉菌S001所含羟基化酶催化形成.分别采用滤纸片法和噻唑蓝(MTT)比色法测定了化合物2的抗菌和细胞毒活性,结果显示化合物2无明显活性.此外,化合物2在100μmol/L时对鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)无抑制活性.结果显示Po TeMs的C-3位羟基化修饰可能发生在多环体系氧化修饰之后.     

嗜盐古菌染色体DNA片段在大肠杆菌中的启动子功能

以启动子探针质粒pKK232-8为载体, 用微量量热法研究了源自盐生盐杆菌R1染色体的RM13 DNA片段在大肠杆菌HB101中的真细菌启动子功能, 该启动子RM13 DNA片段的大小为1000bp(碱基对), 它能启动探针质粒pKK232-8上的氯霉素乙酰水解酶基因(即:氯霉素抗性基因Cmr), 氯霉素抗性水平可达到150 mg•L－1, 抗性水平较高, 启动活性较大.研究结果表明, 在盐生盐杆菌染色体上可能存在具有双功能或多功能的启动子DNA片段, 这对系统发育、微生物遗传学和生物热化学等均有重要的意义.     

血红蛋白片段的合成及生物活性

采用多肽固相合成方法, 以Wang 树脂为载体, Fmoc为N-端氨基酸保护基, HOBt-HBTU为缩合试剂, 合成了一系列血红蛋白α链的片段, 产物经RP-HPLC和质谱进行了确定. 生物活性研究结果表明, 该系列多肽具有较高的血管紧张素Ⅰ转换酶抑制活性, 但不具有α-葡萄糖苷酶抑制活性.     

[B10Glu,B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法,将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu,在B24和B25位之间插入Asp,构建了[B10Glu,B24-Asp-B25]胰岛素原基因.利用通用型质粒pBV220构建表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白为包含体形式,约占菌体总蛋白的20%～30%.经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白.用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物.用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质,用圆二色谱测定了构象变化.放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明,突变体分子缔合性明显下降,放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73.6%和146%.     

[B10G1u,B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法, 将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu, 在B24和B25位之间插入Asp, 构建了\胰岛素原基因. 利用通用型质粒pBV220构建表达载体, 在大肠杆菌DH5α中表达, 表达蛋白为包含体形式, 约占菌体总蛋白的20%～30%. 经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白. 用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切, 经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物. 用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质, 用圆二色谱测定了构象变化. 放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明, 突变体分子缔合性明显下降, 放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73.6%和146%.     

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的高效表达和分离纯化

从病人血清中采用PCR扩增得到了编码HBV-HBsAg蛋白的S基因片段,将其转入PET-His表达载体,构建了原核表达质粒pET-His-HBsAg,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。收获菌体超声波破碎后,梯度蔗糖溶液洗脱杂质。HBsAg在原核系统中高效表达分子量为25 kDa,并得到了纯度为97%的HBsAg蛋白。为进一步研究HBsAg奠定了基础。