甜瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

为了获得新的甜瓜抗病基因同源基因(RGA),我们根据NBS-LRR类抗病基因保守区设计兼并引物组合,以抗病甜瓜品种基因组DNA为模板进行PCR扩增,经筛选、分类与基因测序,获得7个甜瓜RGA序列,其中821与324两个RGA为本研究首次发现.将得到的序列与已知甜瓜RGA序列进行分析、比对,将重复的RGA合并,通过对不同RGA序列同源分析,发现甜瓜CC-NBS-LRR类与TIR-NBS-LRR类RGA的不同分布特征与不同RGA之间的相互关系,如MRGA10与MRGH5可能起源于同一基因.通过对RGA的遗传分析与比较基因组学分析,发现甜瓜RGA序列与抗病基因之间的对应关系,如抗枯萎病基因Fom-1和抗番木瓜环斑病基因Pry存在于nbs47-3(MRGH11)与MRGH21之间,其中候选抗病基因MRGH8推测为Fom-1;候选抗病基因MRGH9、MRGH10之一为Prv.     

半滑舌鳎两种Aquaporinl同源基因的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AQP1o和AQP1基因的全长cDNA序列,并对其序列和表达模式进行了分析.结果表明,AQP1o cDNA全长为993 bp,包括120 bp的5'非翻译区,789 bp的开放阅读框,84bp的3'非翻译区,编码262个氨基酸的蛋白质,分子质量为28.3×103.AQP1的cDNA全长为1 335 bp,包括63bp的5'非翻译区,786 bp的开发阅读框,486 bp的3'非翻译区,编码261个氨基酸的蛋白质,分子质量为27.4×103.聚类分析表明半滑舌鳎AQP1o蛋白与金头鲷和塞内加尔鳎等海洋鱼类在卵巢中特异表达的AQP1o聚为一类,而AQP1与非卵巢特异表达的AQP1聚为一类,表明该两类基因为不同类型的AQP1同源基因.RT-PCR分析表明两个基因具有不同的表达模式,AQP1o主要在卵巢中表达,提示其在卵巢中具有特定的生理功能、而AQP1则在雌雄鱼的多种组织中表达.     

瓯江流域唇NFDA1和花NFDA1线粒体COⅡ基因部分序列分析

采用PCR技术获得了唇NFDA1(Hemibarbus labeo)和花NFDA1(H. maculatus)线粒体DNA细胞色素氧化酶(COⅡ)基因部分序列,将所得的COⅡ基因序列与4种取自GenBank的NFDA1属鱼类同一基因序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、种群遗传结构和分子系统发生研究中的应用价值.测序结果表明,在实际分析的600 bp序列中,序列A T含量(56.9%～57.8%)高于G C含量,物种间共有变异位点116个,其中简约信息位点46个;唇NFDA1和花NFDA12个地理种群间变异位点均为11个,唇NFDA1种群间碱基替换均为转换,花NFDA1的转换/颠换为8/3.以COⅡ基因片段序列为标记,用似刺鳊鮈(Paracanthobrama guichenoti Bleeker)作外群,构建了NFDA1属鱼类的系统发生树,其拓扑结构显示2个地理种群浙江花NFDA1单倍体Ⅰ(H1)与江苏花NFDA1首先聚为一支,然后与浙江花NFDA1单倍体Ⅱ(H2)形成一个单系群.韩国唇NFDA1和日本NFDA1为姐妹群,然后与中国花NFDA1(浙江和江苏)相聚为一支.长吻NFDA1和朝鲜NFDA1单独聚为一支,表明2者的亲缘关系较近.结果同时表明,韩国唇NFDA1与江苏花NFDA1、日本NFDA1和浙江花NFDA1(H1)的遗传距离均为0.008 4,结合形态特征鉴定,推测韩国唇NFDA1和日本NFDA1是中国花NFDA1(浙江和江苏)的同物异名.     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌—杆状病毒穿梭系统（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）将一套含有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐＳ６５Ｔ）和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地形成多角体,并在紫外光照射下产生强烈的绿色荧光,以重组病毒感染粉纹夜蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）幼虫后,在阳光下即可看到发射绿色荧光的幼虫,在手提式长波紫外光照射下绿色荧光更为强烈,带绿色荧光的幼虫在昆虫生态学和杆状病毒流行病学等研究领域有广泛的用途     

HaNPV穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达

ＨａＮＰＶ穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达＊朱应齐义鹏＊＊刘德立（武汉大学病毒研究所，武汉４３００７２）关键词棉铃虫核型多角体病毒，穿梭载体，绿色荧光蛋白基因分类号Ｑ７８，Ｓ８５２．６５杆状病毒表达载体被广泛用于表达各种外源基因．由于...     

抑癌基因bcl-2在玉米染色体中的荧光原位杂交定位

以人的抑癌基因ｂｃｌ－２为探针,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术,发现ｂｃｌ－２在玉米和水稻的基因组中均具有同源序列;并运用荧光原位杂交技术,对玉米中的ｂｃｌ－２同源序列进行了定位．结果表明：ｂｃｌ－２在玉米第４号和第７号染色体上均检出了杂交信号,信号检出率分别为８．１６％和６．６３％．ｂｃｌ－２在第４号染色体长臂上的杂交信号与着丝粒的百分距离为５８．０７±４．９０,在第７号染色体长臂上的杂交信号与着丝粒的百分距离为８０．３４±３．１２．上述研究结果为研究植物细胞程序性死亡的可能调控机制提供了线索,将有利于进一步分析植物与动物细胞程序性死亡的相关性     

MLH1、MSH2基因在散发性左、右半结肠癌中的表达差异及对临床特征的影响

探讨错配修复基因MLH1、MSH2在散发性左、右半结肠患者中的表达差异, 并分析这种差异与结直肠癌临床病理特征的相关性. 收集2015年12月至2018年12月期间, 在宁波市第一医院就诊的133例结直肠癌患者的病例资料, 分析左、右半结肠癌中MLH1、MSH2基因的表达差异, 以及这种差异与结直肠癌临床病理特征的相关性. 结果表明, 在结直肠癌病例中, MLH1、MSH2的表达缺失率与肿瘤的发病部位和分化程度有关(P＜0.05), 右半结肠癌的病例与总体样本表现更相近. 在散发性结直肠癌中, MLH1、MSH2的表达缺失率方面, 右半结肠癌高于左半结肠. 在右半结肠癌病例中, MLH1、MSH2的表达缺失患者相对发病年龄早, 分化程度低, 不容易发生神经浸润; 而在左半结肠癌MLH1、MSH2的表达缺失病例中, 无明显相关表现.     

三角褐指藻DGAT1基因生物信息学分析及表达调控研究

本研究采用转录组测序获得了三角褐指藻DGAT1基因cDNA全长序列(GeneBank登录号: 7200924), 并对其进行生物信息学分析和表达调控研究. 结果表明, 三角褐指藻DGAT1基因cDNA序列全长为1438bp, 开放阅读框(ORF)为1098bp, 编码365氨基酸序列, 含有脂肪酸蛋白特性(I)和DAG结合位点(II)等功能结构域. 预测三角褐指藻DGAT1蛋白为亲水性蛋白, 含有6个跨膜结构域和7个超强跨膜螺旋区, 无信号肽. 进化树分析表明, 三角褐指藻与海链藻DGAT1蛋白同源性最高. RT-qPCR结果表明, 光照强度和温度均显著促进三角褐指藻DGAT1基因的表达. 随着光照强度和温度的增加, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量呈先升高后降低趋势, 在光照强度为2500lx或温度为25℃时, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量达到最大, 这与三角褐指藻总脂含量的变化趋势一致, 同样揭示DGAT1蛋白与三角褐指藻总脂生物合成与积累密切相关.     

β－glucuronidase基因在水稻植株中的表达

采用花粉管通道法，将带β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）基因的ｐＢＩ１２１质粒ＤＮＡ导入栽培稻农垦５８．用荧光法检测ＧＵＳ活性，证明ＧＵＳ基因在水稻转基因植株中得到表达．Ｄｏｔｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ的结果表明经花粉管通道途径导入的外源ＤＮＡ整合到了转基因植株的基因组中．本文还对转基因植株后代的各种变异进行了讨论．     

半滑舌鳎DMRT 1基因的克隆与表达分析

利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的DMRT 1基因;并用RT-PCR技术检测了该基因在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼的不同组织的表达情况.结果表明,该基因cDNA序列全长1 232 bp(GenBank登录号为EU007655),包括774 bp开放阅读框,131 bp5′非翻译区以及含poly(A)信号的329 bp的3′非翻译区,编码258个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎DMRT1氨基酸序列与牙银汉鱼、黑鲷、青鳉、河豚和斑马鱼DMRT1氨基酸序列的同源性分别达到了63%、59%、54%、53%和52%;与光滑爪蟾、小鼠和人类的同源性较低分别为38%、42%和41%.RT-PCR分析表明,DMRT 1基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5、13、18、22和35 d的仔鱼均有表达,在孵化后22 d表达量最高.在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达,其他组织均无表达,表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成.     

草原兔尾鼠透明带3(lZP3)基因序列同源性比较

透明带3作为精子的初级受体是透明带的一种主要糖蛋白,而抗ZP3抗体能够阻止精卵结合.因此,ZP3被认为是避孕疫苗的候选免疫原.草原兔尾鼠是新疆的重要害鼠,将它的ZP3基因序列与GenBank上已发表的几种鼠的ZP3基因序列进行同源性比较,将有助于哺乳动物受精机理的阐明与免疫不育疫苗的设计,同时也有助于了解这些鼠在系统进化中的相对地位.     

玉米kn-1同源盒的高效表达

同源盒基因(homeoboxgenes)在植物,动物,真菌的广泛存在说明这种结构在真核生物进化过程中高度保守,并暗示其具有重要功能.本文将玉米kn-1同源盒插入表达载体pGEM△XbaI,并将形成的重组克隆pGEM△MK转化BL21(DE3)而获得高效表达;表达产物的分子量为29×103,并主要以可溶性蛋白形式存在.Kn-1,Quox-1,OSIH-1间的交叉免疫反应证实三者在蛋白质水平具同源性.而Kn-1同源结构域(Homeodomain)高效表达有助于进一步寻找其靶基因.     

棉铃虫核型多角体病毒朝鲜分离株BamHI-Ⅰ片段的核苷酸序列分析

对在朝鲜首次分离得到的棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株(HaSNPV-KO)基因组BamHI-Ⅰ片段的全序列进行了测序与分析．该片段全长1．895kb．包括p26基因．p10基因及p74基因的3′末端序列．p26基因位于户10基因的上游．排列方向与p10基因相同，该基因的编码区大小为803bp，编码267个氨基酸，p10基因的编码区大小为261bp，编码87个氨基酸．p74基因的排列方向与p10和p26基因相反．棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株与棉铃虫核型多角体病毒中国株(HaSNPV-g4株)的p26基因序列的同源性为99．8％，两个分离株的p10基因序列完全相同，而p74基因3′末端序列的结果有99．4％的同源性．朝鲜株与美洲株(HzSNPV)的p26和p10基因序列的同源性分别为98．8％，98．7％，而p74基因3′末端序列有97．9％的同源性．     

新城疫病毒HB 92株M基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)无毒耐热株(HB92株)M基因，将其克隆于pGEM-T载体，并进行了序列测定和分析．结果显示，测定的M基因长1223个核苷酸。包含一个1095个核苷酸的开放阅读框(ORF)，编码364个氨基酸．与已报道的10株NDVM基因比较，核苷酸同源性为88．4％～95．8％，氨基酸同源性为89．8％～95．3％。HB92株与V4株M基因核苷酸的同源性最高(达95．8％)．NDVM蛋白分子中有9对碱性氨基酸。在多肽的第117～120位有一个含4个氨基酸CKKS的特征性结构．这些结果为揭示NDV HB92株的分子生物学背景，了解NDV的分子进化和遗传变异机理，进而开发利用HB92株奠定了基础，也为将NDV另列为副粘病毒亚科的一个新属提供了理论支持．     

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)cbn1和cao突变基因的对比分析及CAO基因的分子定位

用电击法将带有CAO基因片段的P sp109-E 8质粒转入到莱茵衣藻cbn1-48m t 基因突变株中后,转化子中出现了叶绿素b的恢复性表达,初步验证了丧失合成叶绿素b能力的cbn1和cao突变基因具有等位性的属性;将1641-1b(cbn1-43 m t )和CC-1354(cbn1-48 m t )突变株分别与CBS5(cao5 m t-)突变株的分离子CBS5-c1和CBS5-c5进行杂交,并通过随机分析方法分离获得1842个减数分裂后代分离子,经检测其中均没有发现有野生性表型的分离子,初步证明cbn1和cao 4突变基因间有着非常紧密的连锁性;从上述杂交系分离获得的50多个四分子中也没有检测发现显示野生性表型的分离子,进一步证明了cbn1和cao突变基因具有等位性的属性;根据CAO基因的DNA序列,从5′-端和3′-端设计两个探针,分别与莱茵衣藻核基因组Ⅰ号染色体上GBP 1和RB 47分子标记之间的21个BAC克隆进行的点杂交实验结果显示,该两个探针序列与21号BAC克隆(莱茵衣藻BAC文库序列号33e2)片段均有同源区的特性,此项DNA杂交实验初步证明,CAO基因的位点是在cbn1突变基因左右两侧的GBP 1和RB 47两个分子标记之间的33e2 BAC克隆片段区.     

人nov基因全长cDNA克隆、测序及其组织表达谱分析

采用特异性mRNA富集技术，从人早期胚胎中得到人nov基因(novH)的cDNA克隆，序列分析表明，该基因cDNA序列由2389个碱基对组成，包含一段长1071bp的开放阅读框(ORF)，3′端含有加尾信号AATAAA和ply(A)尾巴。Northern杂交显示，在Hela细胞和肾上腺组织中有表达的novHmRNA，大小约为2．5kb；多组织RNA点杂交分析结果进一步表明，novH基因在肾上腺和主动脉中的表达水平相对较高，在成人肾、肝、肺和小肠组织中亦有少量的表达。     

bop基因及其上游启动子的克隆与表达

应用重组PCR的方法，直接从盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)S9的基因组DNA上扩增到了编码细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)的基因——bop基因及其启动子部分(1196bp)，并将其克隆到表达载体pXLNovR后，在宿主菌株中得到了表达．测序结果表明，扩增得到的片段与NCBI数据库中的bop基因及启动子的序列完全相同，且其表达产物的分子量与野生型BR蛋白的分子量一致，并且在568nm处表现出BR蛋白特征吸收峰．本方法与其他方法(如逆转录PCR，建立基因文库后从中调取等方法)相比具有操作简便，成功率高的优点．     

稀有鮈鲫（Rare gudgeon）Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物，采用PCR技术在稀有鮈鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增，发现3个大小分别为220、700和1500bp的片段，经过克隆和测序分析，从220bp的片段中获得两个基因片段，证明为稀有鮈鲫的Sox1和Sox21基因片段，无性别差异，其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1：80．4％和97％；Sox21：77．3％和9l％，其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox：96％和98％；Sox21：88％和100％，显示了其高度的保守性．此外，从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克降的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据．通过对这些数据进行序列比对及策类树的构建，分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式，对稀有鮈鲫的性别决定进行了探讨，为Sox基因的进化研究提供分子基础．     

猪瘟病毒HCLV株E_2核苷酸序列与结构分析

用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ技术从 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ Ｈ Ｃ Ｌ Ｖ 株 Ｆ４８２ 代感染兔脾的细胞总 Ｒ Ｎ Ａ 中分段扩增出了 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ Ｅ２ 基因特异的３ 个部分重叠的 Ｄ Ｎ Ａ 片段（大小分别为 ４９９ ｂｐ、５７２ ｂｐ 和 ２４５ ｂｐ）,并将之分别克隆到ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｔ 载体上 经核苷酸序列测定和片段重叠完成了包含 Ｅ２ 全长基因的 １ １４４ ｂｐ 序列的测定,其 Ｇ Ｃ含量为４９．０％ ：核苷酸序列与国外报道的各株病毒的 Ｅ２ 基因同源性分别为８３．５％ ～９７．５％ ;其推导的氨基酸序列的同源性也分别为８９．３％～９６．２％ ,变异主要分布在 Ｅ２ 蛋白的 Ｎ 半部分